3~30ku蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌病治疗效果的研究.docVIP

3~30ku蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌病治疗效果的研究 　　摘要 为探明3~30ku蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌病的治疗效果,试验采用体外抑菌试验及电镜观察,表明3~30ku蚯蚓抗菌肽对巴氏杆菌有明显抑菌效果;动物试验的血液中细菌动态变化、白细胞与炎性因子的测定和临床结果显示,蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌病的防治效果明显;高剂量组治愈率高达100%,中剂量组次之,而低剂量组则效果不明显。 　　关键词 蚯蚓抗菌肽;兔巴氏杆菌病;治疗效果 　　中图分类号Q965文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)18-0299-03 　　 　　目前人们已采用现代生物技术从蚯蚓中提取了多种生物活性成分,包括抗菌肽、纤溶酶、抗氧化物以及抗肿瘤成分等[1]。研究证明蚯蚓提取物有抑菌杀菌、促进创伤愈合、抗血栓、抗肿瘤及提高机体的免疫力等功效[2-3]。抗菌肽对细菌、真菌、癌细胞、病毒、原虫具有广泛的杀伤活性,与传统的抗生素相比,具有分子量小、广谱抗菌、热稳定性好等特点[4-6]。蚯蚓抗菌肽在抑菌等方面的作用报道较多,如赵东红等[7]从蚯蚓体内分离得到抗菌肽LumbricusⅠ,体外试验证明具有广谱的抗菌特性。郑津辉等[8]证明了蚯蚓抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。但对3~30 ku蚯蚓抗菌肽的研究还尚未见报道,试验拟采用3~30 ku蚯蚓抗菌肽对兔巴氏杆菌的抑菌作用进行研究,探明其抑菌效果。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　3~30 ku蚯蚓抗菌肽:采用超滤离心从蚯蚓体内提取获得,蛋白浓度为8.82 mg/μL。菌种由巴氏杆菌由中国科学院微生物研究所提供。培养基包括普通琼脂培养基、血清肉汤培养基等。供试仪器:高压灭菌锅、分光光度计、全自动血液分析仪、酶标仪、扫描电镜、离心机等。供试动物:体重相近的30只健康兔,雌雄各半,约2.0 kg。 　　1.2菌种的复壮 　　将冻干粉状的巴氏杆菌于血清肉汤培养基中,37 ℃培养24 h左右,进行菌体计数约为4 000个菌/mL,取0.1 mL皮下注射小白鼠,待小白鼠死亡后取肺组织,剪碎,加PBS混匀,离心取上清液0.1 mL继续皮下注射小白鼠,直至第5代小白鼠。 　　1.3体外抑菌活性测定 　　1.3.1微量抑菌试验。将分离提纯和过滤除菌的3~30 ku蚯蚓抗菌肽作1.0、1.5、3.0倍稀释,按10 μL/孔依次加入无菌的96孔微量板的肉汤培养基中,再加入菌液(4 000个菌/mL)10 μL,并作空白对照,做5个平行值,分别用酶标仪测得各孔OD值,将96孔微量板放入37 ℃恒温箱培养24 h左右后,测得各孔OD值,比较观察抑菌活性。 　　1.3.23~30 ku蚯蚓抗菌肽对巴氏杆菌形态的影响。将10 μL 3~30 ku蚯蚓抗菌肽加入到血清肉汤培养基中,再加10 μL巴氏杆菌约40个菌体,37℃培养24 h,3 000r/min离心收菌,菌体用PBS洗涤3次,洗涤后制成悬浮液,冰箱4 ℃过夜固定。取悬浮液加在胶片上,干燥后,真空下溅射喷金,于扫描电镜下观察菌体外观形态和结构变化。 　　1.4体内试验 　　1.4.1动物试验设计。将30只健康试验兔随机分为5组,编号为1、2、3、4、5组。每组6只,2~5组注射0.5 mL菌液(40个菌/mL)攻毒4 h后进行处理[9],其中1组为正常组(CG),肌肉注射生理盐水6 mL,连用5 d;2组为感染对照组,肌肉注射生理盐水6 mL,连用5 d;3组为高剂量组,肌肉注射3~30 ku蚯蚓抗菌肽6 mL,连用5 d;4组为中剂量组,肌肉注射3~30 ku蚯蚓抗菌肽4 mL+生理盐水2 mL,连用5 d;5组为低剂量组,肌肉注射3~30ku蚯蚓抗菌肽4 mL+生理盐水4 mL,连用5 d。 　　1.4.2检测指标。攻毒后每天观察试验兔的临床表现,分6、18、32、48 h进行静脉采血测定其血液中白细胞(WBC)与嗜中性细胞(NC)的数目,48 h后所有兔处死,并取肺组织置于-80 ℃下,备用。 　　1.4.3兔体内细菌动态繁殖试验。攻毒后于6、18、32、48 h采取所有兔的血液用微量接种菌落计数法进行活菌计数。 　　1.4.4炎性因子TNF-α和NO的含量测定。取出待测肺组织约1 g,用PBS匀浆后,4 ℃、1 200 r/min离心20 min,收集上清液,利用ELISA法测定其炎性因子TNF-α和NO的含量。 　　2结果与分析 　　2.13~30 ku蚯蚓抗菌肽的体外抑菌活性 　　2.1.1微量抑菌试验效果。酶标仪测定OD值结果如表1所示。由表1可知,高剂量组OD变化值与空白对照组最为显著,中剂量组也比较显著,低剂量则效果不明显。 　　2.1.2蚯蚓抗菌肽作用巴氏杆菌的电镜扫描结果。电镜扫描结果显示: