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Western Blot蛋白测定步骤 三蒸水制备后需要高压消毒 一、组织的采集 （一）器材和试剂准备： 镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮 （二）步骤（以心脏为例）: 1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号 2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中 3、组织于-80摄氏度冻存 二、组织蛋白的提取： （一）器材和试剂准备： 4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、 RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF （Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水 （二）步骤 1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻 2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管 3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止 4、静置于冰盒30分钟 5、12000rpm，4摄氏度，30分钟 6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。前者用于测试，后者备用。-80摄氏度冻存。 注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存 三、蛋白上样量定量 采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）： （一）器材和试剂准备： 1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液 （二）步骤 1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。（加好各试剂，混合于37摄氏度放置30分钟） 2、使用Amersham Biosciences GeneQuant Pro分光光度计的562nm测试，读数三次，取平均值（ug/mL） 四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（各浓度的配制见配方表） SDS试剂配制 1） 30%丙烯酰胺溶液： 丙烯酰胺（Acrylamide） 29.0g 　　 亚甲双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide） 1.0g 　　 dddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4 2) 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-Hcl ( PH 8.8） Tris 18.15g 1mol/L HCL 调节PH（可以使用分析纯级别的浓盐酸，下同） dddH2O 定容至100mL，4℃ 3) 浓缩胶缓冲液1.0mol/L Tris-Hcl (PH 6. 8）： Tris 12.1g 1mol/L HCL 调节PH dddH2O 定容至100mL，4℃ 4) 10% SDS溶液： SDS 10.0g dddH2O定容至100ml，室温保存 5） 10%过硫酸铵（AP）： 过硫酸铵 0.1g dddH2O定容至1.0ml，4℃ 6）TEMED 遮光保存，分装于EP管冻存 五、电泳 （一）器材和试剂准备： 电泳仪、电磁锅、浮板、离心机、1.5mL离心管、Marker、5×上样缓冲液（loading buffer）、生理盐水、电泳液 5×SDSLoading Buffer配制方法 5×SDSLoading Buffer配制方法 （20mL体系总体积） ： 　　DTT （DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇）（0.1M） 1.54g SDS（sodium dodecyl sulfate） 　 2.0g 　　1M Tris-CL（pH6.8） 8.0mL 溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至20mL （二）步骤 1、电泳上样体系总25uL（即每孔加25uL） ：（下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂） 　 Marker管（泳道） 蛋白样品管（泳道） 空白管（泳道） 蛋白 无 ？ 无 5×loading buffer 5uL 5uL 5uL Marker 7uL 无 无 生理盐水 13uL 补齐至25uL 20uL 体系总体积 25uL 2