多胺促进霍山石斛类原球茎芽发生及作用机理的.doc

多胺促进霍山石斛类原球茎芽发生及作用机理的 多胺促进霍山石斛类原球茎芽发生及作用机理的 霍山石斛是我国名贵的食用药用植物,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、清音明目的保健功效。由于霍山石斛野生资源缺乏,人工栽培困难,组培苗繁殖系数低并残留外源激素,因此在数量上及安全上不能满足医药和功能食品开发的需求。本文对霍山石斛无外源激素残留高效繁殖体系建立,及其生理生化与分子机理进行了研究,以期为含有霍山石斛医药及保健功能产品的加工生产提供基础。本文取得的主要研究结果如下: 1、对霍山石斛类原球茎芽发生过程中内源多胺含量进行检测,表明多胺可能是类原球茎芽发生的促进因子。在芽发生过程中内源亚精胺(Spermidine,Spd)和腐胺(Putrescine,Put)的含量显著提高,总内源多胺水平与芽发生呈正相关。多胺生物合成抑制剂MGBG(Mmethylglyoxal(bis)-guanylhydrazone)和DFMO(α-Difluoromethylomithine)可完全抑制类原球茎的芽发生。 2、以霍山石斛类原球茎为实验材料,对外源添加的多胺种类及浓度进行筛选,建立了无外源激素的高效芽发生的培养体系。其中在MS培养基中外源添加 2.0 mmol/L的Spd或Put对霍山石斛类原球茎芽发生的促进作用最为显著。外源多胺可以通过增加内源多胺的水平,解除多胺生物合成抑制剂MGBG和DFMO对类原球茎芽发生的抑制作用。 3、内源激素水平分析表明,外源多胺可显著提高内源细胞分裂素(Cytokinins,CTKs)水平,降低内源生长素吲哚乙酸(Indole acetic acid,IAA)水平,因此导致总CTKs/IAA比值升高,促进芽的发生。内源激素代谢相关酶活性分析表明,外源多胺对内源激素水平的改变与上调吲哚乙酸氧化酶(IAA oxdiase,IAAox)活性,下调细胞分裂素氧化酶(Cytokinin oxdiase,CKX)活性相关。在芽发生的第21 d,外源多胺Spd组、Put组CTKs分别是对照的 1.7倍、 2.2倍,IAA水平分别是对照的 1.4倍和 1.9倍,CTKs/IAA分别是对照的 2.4倍和 4.6倍。多胺生物合成抑制剂MGBG和DFMO可抑制类原球茎芽发生过程中内源激素水平和相关代谢酶活性的改变,补充外源多胺可以部分恢复内源激素水平和相关代谢酶活性。 4、细胞内过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_2O_2)水平分析表明,H_2O_2可能参与了外源多胺促进的芽发生作用。外源多胺作用5 d时,多胺组中H_2O_2含量高达对照组的17 5.6%(Spd)、和180.6%(Put);相关H_2O_2产生酶——多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)活性显著升高。H_2O_2淬灭剂二甲基硫脲(Dimethylthiourea,DMTU)对类原球茎芽发生具有抑制作用,补充外源多胺(Spd或Put)可以使该抑制作用部分解除。 5、采用RT-PCR和快速扩增eDNA末端方法(RACE)克隆出霍山石斛CKX基因(DhCKX)cDNA全长序列。该序列含有一个编码537个氨基酸的开放阅读框,预测分子量为60.383kDa,核苷酸和氨基酸序列与“Sonia”石斛DsCKX的同源性分别为9 2.2%和89.9%。RT-PCR分析表明,外源多胺可通过下调DhCKX基因的表达,降低CKX活性,提高细胞内源细胞分裂素水平,促进芽的发生。多胺生物合成抑制剂MGBG和DFMO可上调DhCKX基因表达,同时补充外源多胺可以使DhCKX基因表达水平与对照接近。 摘要8-9ABSTRACT9-11致谢11-20第一章 绪论20-361 霍山石斛的化学成分与药用保健功能20-24 1.1 霍山石斛的化学成分20-22 1.2 霍山石斛的药理研究22-242 霍山石斛的生物学特性、资源现状与再生途径24-29 2.1 霍山石斛的生物学特性24-25 2.2 霍山石斛的资源现状25-26 2.3 霍山石斛资源再生途径26-29 2. 3.1 组织培养26-27 2. 3.2 人工栽培27-293 目前存在的问题29-304 本论文研究内容及意义30-31 参考文献 31-36第二章 外源多胺对霍山石斛类原球茎芽发生的影响36-49 1.材料与方法36-39 1.1 材料36-38 1. 1.1 主要仪器36-37 1. 1.2 主要试剂37 1. 1.3 植物材料、培养基及培养条件37-38 1.2 方法38-39 1. 2.1 霍山石斛类原球茎芽发生过程的形态学观察38 1. 2.2