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Western blot 实验介绍 及流程;垂直电泳、电转装置;Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体（一抗）起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。;Western blot 检测蛋白表达实验流程;SDS电泳的基本原理;PAGE：聚丙烯酰胺凝胶;聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：;一 配分离胶 准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：; ; 灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。;灌制分离胶 隔绝空气;二 配制浓缩胶 准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温） 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝了。 倾倒掉胶上层的异丙醇，后用吸水纸吸干。 注意吸水纸不要触碰分离胶 10%的分离胶配合6%的浓缩胶使用。配制浓缩胶，配方如下： ;6%的浓缩胶;配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后震荡。 灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻??板流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。 ;浓缩胶的浓度比较低（5%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上（因为在你加样的时候蛋白是分布在加样孔中的， 不在同一水平线上。） ?分离胶的胶浓度比较大（10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被拦住，就跑的慢。通过这种方式以分子量大小的区别来分离蛋白质 ;插梳子;三 电泳：;3·1 固定;3·2 上样 蛋白质样品的提取与制备 蛋白浓度的测定 计算上样量 用微量注射器吸取蛋白加入到上样孔中。一般蛋白MARK的上样孔在两边。 ;3·1·1 蛋白样品制备 （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、 倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸使其吸干培养液。 2、 向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔， 12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min 3、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺 子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作） 4、 于4℃下12000rpm离心5min。 5、 将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80℃保存。 ; （2） 组织中总蛋白的提取： 1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）