65FFF4_CHAPTER 3 DNA的分析方法980325一培训资料.pptVIP

9804015 課程內容 第三章(下)：PCR、DNA定序法、 RNA干擾技術、基因剔除技術 影片：本週暫停, 期中考總複習 Q1: 全班分成6組 (含實驗和專題討論) 3-1　聚合酶連鎖反應 聚合連鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）是一種能在體外快速且大量複製DNA的技術，由Kary B. Mullis於西元1985年發明，並因此獲得諾貝爾獎。 PCR 動畫影片 PCR反應需具備的條件和材料，分別如下： (1)要被複製的DNA模板（template）。 (2)界定複製範圍兩端的引子（primer）：可分別和DNA的雙股配對結合，作為合成新股的起點。 (3)DNA聚合酵素（taq polymerase）：將四種核苷酸催化聚合成一新的互補的DNA鏈。 (4)合成DNA的原料：其中包括了dATP、dTTP、dGTP、 dCTP等四種核苷酸。 PCR的反應包括了三個步驟，分別是「變性」、「黏合」、「延展」等三個步驟（如圖3-1所示）： (1)變性：使用高溫（93～95℃），使雙股DNA變性， 分開成單股的DNA，以作為往後複製的模板。 (2)黏合：使引子於一定的溫度下（通常在40～55℃之 間），黏合於單股DNA模板上，作為合成新股的起 點。 (3)延展：以單股的DNA作為模板，引子為起點，在 DNA的聚合酵素的催化及適當溫度（約72℃）的作 用下，將四種核苷酸催化聚合成互補的DNA鏈。 完成了這三個步驟即為一個循環，每個循環可使DNA的量增加一倍。若重複操作n次，DNA增加的量將會是2n倍。一般一個PCR反應須進行25～30個循環，在數小時內即可將作為模板的DNA複製千萬倍以上。 圖3-1　聚合酶連鎖反應的原理 3-4　DNA定序法 Sanger於1977年開發出鏈終止（chain termination）定序法，定出了一個病毒DNA的完整序列5375個碼，這是當時最簡便的DNA定序法，也是後來自動定序的基礎，使他獲得1980年諾貝爾獎。 定序動畫影片 鏈終止法以樣品DNA作為模板，分成四組，同時使用DNA聚合酶在試管中合成DNA的長鏈，然後將四種核苷酸的類似物（ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）分別加入這四組進行中的DNA合成反應，一旦DNA聚合酶以其做為原料之後，DNA長鏈的合成就被終止，利用此原理，部分合成反應會停在該核苷酸類似物處，造成各種長短不一的DNA片段，以電泳分離，即可判讀樣品DNA序列。 鏈終止法所得到的各種長短不一的DNA片段，以電泳分離，跑的最快的股鏈為第一條條帶，代表最小的DNA分子及第一個被ddNTP終止的股鏈，依此類推，即可判讀DNA序列。 圖3-4中經判讀出來的樣品DNA之互補序列為GACGCTGCGA，所以樣品DNA之實際序列為CTGCGACGCT。 圖3-4 DNA定序－Sanger的鏈終止法 3-5　RNA干擾技術 DNA轉錄成RNA，RNA再轉譯成蛋白質，這種「DNA→RNA→蛋白質」的運作型式稱為生物的中心法則。而RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術則是破壞RNA，使得蛋白質無法產生，換言之，RNA干擾技術使得基因沈默下來，雖然生命的設計藍圖DNA仍然完好，但卻不能發揮其指導蛋白質製造的功能。 RNA干擾現象首先在1998年由費爾（Andrew Fire）與梅洛（Craig Mello）在線蟲實驗中注射某肌肉蛋白之mRNA因而發現。 共享4500萬獎金費爾與梅洛1998年在《自然》期刊上初次發表研究成果，2002年美國醫學期刊《科學》則將RNAi列為當年最重要的突破性發現。負責評選的瑞典卡洛林斯卡學院成員之一莫勒（Erna Moller）指出，RNAi的研究成果發表後，「立刻出現許多新公司」專門根據這項發現研發新藥。不過有分析家指出，RNAi技術太新，相關療法一旦實際應用時，技術與安全問題不可輕忽。費爾與梅洛兩人將共享1000萬瑞典克朗（約台幣4500萬元）的獎金，頒獎典禮將於12月10日於瑞典斯德哥爾摩舉行。 兩人獲獎感言及簡介費爾（Andrew Z. Fire)「一開始當然不相信，以為可能是做夢或對方打錯電話……我還是原來的我，我的目標還是一樣簡單，科學研究、教書與家庭，這些是不變的。」˙年齡:47歲˙國籍:美國˙學歷:麻省理工學院生物學博士˙現職:史丹福大學醫學院病理學與遺傳學教授 梅洛（Craig C. Mello）