表观遗传学沉默dach1抑制tgf-β信号通路并促进食管癌的生长-内科学(消化系病)专业论文.docxVIP

解放军医学院博士学位论文 解放军医学院博士学位论文 万方数据 万方数据 作 者：吴亮 学科专业：内科学（消化系病） 导 师：郭明洲 研究员 表观遗传学沉默 DACH1 抑制 TGF-β 信号通路 并促进食管癌的生长 中文摘要 背景及目的 食管癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国分 别位居恶性肿瘤的第五位和第四位。食管鳞状细胞癌（食管鳞癌）是食管癌的主要病 理类型之一，在我国的中西部地区，食管鳞癌约占整个食管癌病理类型的 90%。食管 癌的发病机制仍然不清，但是，越来越多的研究表明，遗传学（基因突变、杂合子丢 失、纯合子缺失等）和表观遗传学（DNA 甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、非编 码 RNA 等）的改变在食管癌发生、发展中起重要作用。DACH1 是视网膜决定基因 网络的重要组份，存在于多种上皮细胞中。DACH1 在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、子 宫内膜癌和肝细胞癌等肿瘤中表达降低，并且与患者不良预后相关。DACH1 在子宫 内膜癌、结肠癌和肝细胞癌中的表达受基因启动子区甲基化调控。此外，在肝细胞癌 中，DACH1 可以通过激活 TGF-β 信号通路发挥抑癌作用。本研究旨在探讨 DACH1 在食管鳞癌中的表观遗传学改变、作用及其机制。 方法 采用半定量 RT-PCR 方法检测去甲基化药物 5-aza-2’-deoxycytidine（5-AZA）处 理前后，11 株食管鳞癌细胞系中 DACH1 mRNA 的表达水平；采用甲基化特异性 PCR 方法检测 11 株食管鳞癌细胞系、10 例正常食管黏膜、51 例食管不典型增生以及 104 例原发性食管鳞癌组织样本中 DACH1 启动子区的甲基化状态；采用免疫组化方法检 测 30 例食管鳞癌组织和配对的癌旁组织样本中 DACH1 的表达水平，并分析 DACH1 表达水平与基因启动子区甲基化之间的关系；采用流式细胞技术、克隆形成实验以及 2 裸鼠移植瘤模型，探讨 DACH1 在食管癌中的生物学功能；采用双荧光素酶报告基因 系统，在 DACH1 低表达的食管鳞癌细胞系中检测 DACH1 对 TGF-β 信号通路的影响； 采用重组 DACH1 慢病毒感染或 siRNA 沉默的方法分别处理 DACH1 低表达或高表达 的食管鳞癌细胞系，运用 Western Blot 方法检测 DACH1 对 TGF-β 信号通路下游蛋白 表达的影响。 结果 DACH1 在 KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE180、KYSE450 和 KYSE410 细胞系中表达，在 TE8 细胞系中表达降低，而在 KYSE150、KYSE510、TE1 和 TE3 细胞系中表达缺失。KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE180、KYSE450 和 KYSE410 中 DACH1 启动子区呈非甲基化状态，TE8 中 DACH1 启动子区呈部分甲基化状态， 而 KYSE150、KYSE510、TE1 和 TE3 中 DACH1 启动子区呈完全甲基化状态。去甲 基化药物 5-AZA 处理后可以恢复 KYSE150、KYSE510、TE1 和 TE3 细胞系 DACH1 mRNA 表达。在 18.8%（6/32）的食管轻度不典型增生、42.1%(8/19)的中重度不典型 增生以及 61.5%（64/104）的原发性食管鳞癌组织样本中检测到 DACH1 启动子区高 甲基化改变，而在 10 例正常食管黏膜中均未发现 DACH1 启动子区甲基化改变。 DACH1 启动子区甲基化频率随着食管癌变的进展呈现累积性改变（P 0.01），并且 DACH1 甲基化与食管鳞癌组织低分化（P 0.05）和肿瘤晚期（P 0.05）相关。在 食管鳞癌细胞系 KYSE150 和 KYSE510 中，恢复 DACH1 表达可以激活 TGF-β 信号 通路并抑制细胞增殖和克隆形成。恢复 DACH1 表达可以抑制 KYSE150 和 KYSE510 细胞裸鼠移植瘤的生长。 结论 DACH1 在食管鳞癌中频繁发生启动子区甲基化，并且 DACH1 启动子区甲基化 是食管癌变过程中的早期事件。食管鳞癌中，DACH1 的表达受启动子区甲基化的调 控。DACH1 通过激活 TGF-β 信号通路发挥抑制食管癌生长的作用。 关键词： DACH1，DNA 甲基化，转化生长因子-β（TGF-β），食管鳞状细胞癌 3 Epigenetic Silencing DACH1 Promotes Esophageal Cancer Growth by Inhibiting TGF-β Signaling Abstract Background Aims Esophageal cancer is the fifth most ma