阿魏菇凝集素分离纯化及性质研究-农产品加工及贮藏工程专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Study on the Purification and Properties of Lectin from the Pleurotus ferulae Lenzi A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Engineering By Yang Ai-xia (Processing and storage of agriculture) Dissertation Supervisor:Prof. Li ying-biao Xu Cheng-jian June,2014 阿魏菇凝集素分离纯化、理化性质及部分免疫活性研究 阿魏菇凝集素分离纯化、理化性质及部分免疫活性研究 摘要 本文选用新疆特色资源阿魏菇为对象，对其分离纯化、理化性质及部分免疫活性进 行研究。 ①阿魏菇凝集素(pleurotus ferulae Lectin，PFL)的分离纯化 采用 PBS（phosphate buffer saline）浸提、硫酸铵分级沉淀、超滤浓缩、离子交换 层析初步分离以及琼脂糖凝胶亲和层析法纯化的方法提取出了纯度较高的 PFL。选用 的层析柱长为 36 cm，直径为 1.1 cm，离子交换层析选用 DEAE-cellulose52，柱材料与 填料比为 3：1；亲和层析的填料为 NaOH 活化过的 Sepharose-4B，柱材料与填料比为 1：1，用 PBS 平衡液洗脱杂蛋白至 A2800.02，收集洗脱液透析处理，经过电泳实验 无蛋白条带；再用 0.25 mol/L D-半乳糖溶液解吸附至 A2800.02，流速为 1mL/min， 收集洗脱液透析，电泳，观察到单一蛋白条带电泳，表明 PFL 是由单一亚基组成的单 聚体，并证实得到纯度较高的 PFL。 ②PFL 电泳 SDS和非变性 PAGE 结果均得到单一蛋白带，分子量 17.5kDa 左右，考马 斯亮蓝 R-250 绘制标准曲线测得阿魏菇凝集素蛋白含量为 84.33%。Native是在 不破坏蛋白的天然结构和电荷的条件下，依据天然蛋白自身所带电荷和在电场与介质 中泳动，可以鉴定分离到的蛋白的纯度，同时有利于蛋白的回收利用。 ③PFL 凝血活性研究 阿魏菇凝集素的最高凝集效价为 28；温度在 0-60℃，凝血活在 70℃以上稳定，凝 血活性完全消失，证明该 PFL 不耐高温；凝集素在 pH 环境高于 2 的酸性环境中稳定， pH＞10 以上的碱性环境下，凝集素凝血活性全部消失；凝集素活性随盐度升高而增加， D-半乳糖可以有效的抑制 PFL 凝血活性，金属离子 Zn2+显著增强凝集素的凝血活性。 ④PFL 的基础免疫活性研究 观察凝集素对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用。采用 MTT 法，以不同浓度的凝集素 与脾淋巴细胞共孵育 48h，二甲基亚砜终止培养，测定细胞培养液的吸光度值，检测 凝集素对淋巴细胞的增殖作用。由结果可知小鼠淋巴细胞的增殖作用与凝集素呈剂量 依赖关系，添加量仅为 80μg/mL，就有显著的增殖作用。阿魏菇凝集素还能促进小鼠 腹腔巨噬细胞产生 NO，NO 水平的增加使巨噬细胞发挥其免疫调节作用和杀伤肿瘤的 功能，凝集素浓度在 40μg/mL 及以上便可以刺激巨噬细胞产生大量的 NO，增强器免 疫活性。以上结论为阿魏菇凝集素免疫调节活性的研究提供了理论依据。 关键词：凝集素；纯化；凝血活性； I Abstract The purpose of this study was to extract and purificate one lectin from the Pleurotus ferulae and mainly study the basic physical and chemical properties of lectins and part immunomodulatory activity were obtained for build a solid foundation at the further PFL’s exploration in the in theory. 1 Lectins separation and purification from the Pleurotus ferulae. The highly purified lectin was recived by PBS (phosphate buffer saline) extraction of fruit body mash, salting out with ammoni