PCR技术和应用-(精品课件).ppt

基因工程 闫丽 一、概述 二、DNA重组克隆的单元操作 三、基因工程相关技术 四、大肠杆菌基因工程 五、酵母基因工程 六、高等动物基因工程 七、高等植物基因工程 第三章 基因工程相关技术 第一节 DNA文库的构建及筛选技术 第二节 PCR技术及应用 第三节 大分子的分离与分析 第四节 生物芯片技术 小结 PCR原理、特点 PCR类型 PCR产物克隆 谢谢！ 二、PCR的类型 1. 反向PCR(inverse PCR) 一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。 扩增原理： 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 2.利用接头的PCR 3.热不对称交错PCR TAIL-PCR的基本原理： 利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD，约14bp）相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 4.多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 负极 正极 5.LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 6.定点突变PCR 7.原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。 操作步骤 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照 B.阴性对照 C.原位检测mRNA表达 8）cDNA末端的快速扩增（rapid amplification of cDNA end,RACE) (a) 5’RACE： GSP3 设计引物，合成cDNA第一链 AAAAA…..AAAAn Poly(A)尾 TTTTT …..TTTT 5’ AP AAAAA…..AAAAn TTTTT …..TTTT 5’ 用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链 TTTTT …..TTTT 5’ -------------------------------------- --------------------------------------- --------------------------------------- TTTTT …..TTTT GSP1 AUAP GSP2 (b) 3’RACE 特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增 9.实时定量PCR( real-time PCR) 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析 定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析 （1）原理： 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。 SYBR荧光染料（ SYBR green Ⅰ) （2）荧光标记方式 荧光标记 PCR技术： PCR技术又称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，是通过模拟体内DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。 PCR概念的提出 1985，Kary Mullis 1993年诺贝尔化学奖 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。 Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process… thermus aquaticus Taq DNA多聚酶的发现 1988年Saiki 等从温泉（?Hot?spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(th