基因工程5-2 (简要) 基因分离、重组与重组体向受体细胞导入.pptVIP

5.1.3 从真核生物分离纯化目的基因 从真核细胞直接分离基因难度很大，原因是： 第一，真核细胞中单拷贝基因只占染色体DNA很小一部分，大约10-5~10-7，因此从染色体直接分离纯化目的基因犹如大海捞针，机率很小； 第二，真核染色体DNA一般都很大，组建物理图谱和进行基因定位决非易事，因此不能对其进行直接分离； 第三，真核基因内一般都有间隔序列（又称内含子，intron），如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出了真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，由真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA。 为了得到真核基因，一般是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 5.1.3.1 cDNA文库的构建 1. 总RNA提取 在真核细胞中，mRNA约为总RNA的1~5％，提取特异mRNA，需要选择特异而高度分化的组织。例如，胰岛素基因的mRNA在胰脏组织中含量丰富，珠蛋白基因的mRNA在血红蛋白细胞中含量丰富。因此，能否选择到富含某种特异mRNA的组织细胞，是获得大量纯化mRNA的关键。 mRNA的转录和加工在细胞核中进行，肽链合成在细胞质中进行。成熟的mRNA分子要转移到细胞质中进行转译。 从细胞中提取RNA时要注意，由于RNA酶不易失活，在分离RNA时，抑制RNA酶的活性特别重要。提取的程序为： (1)? 沉淀细胞 (2)?裂解细胞，一般使用NP-40去污剂，它使细胞裂解但不破裂细胞核。 (3) 离心去除细胞残渣，上清液以酚-氯仿(或SDS)抽提，除去蛋白质，取水相用95%冰乙醇沉淀RNA，即可得到总RNA。 2. mRNA的分离与纯化 (1)?poly(A) RNA的分离：真核细胞mRNA的3’-端含有poly(A)序列，这一重要特性常被用于从总RNA中将poly(A) RNA分离出来的手段。最常用的寡聚(dT)纤维素亲和层析柱在含0.5M NaCl缓冲液中时，多聚(A)与寡聚(dT)配对，poly(A) RNA被吸附于柱上，其他不含poly(A)序列的RNA自柱流出，然后用不含NaCl的缓冲液将poly(A) RNA洗脱下来。 (2) mRNA的分级：根据每种特定的mRNA都有其一定的长度（即一定的分子量），将总poly(A) RNA通过蔗糖梯度离心或琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分级，回收特定的某一分子量的组分，这样特异的mRNA就相对的被富集了。不过分子量相近的不同mRNA不可能分开，这种分级方法一般只能富集3~8倍。 3. mRNA转译活性的鉴定 mRNA有无转译活性是鉴定某种mRNA质量的重要指标之一。有两种转译系统： * 体外转译系统（无细胞转译系统）：如兔网状细胞裂解产物或小麦胚抽提物等已有商品出售（BRL或NEN），也可以自己制备。该方法可用于试验各个组分的作用，易于纯化蛋白产物，且能分离前体蛋白；但转译慢，效率较低。 * 体内转译系统：如非洲爪蛙卵母细胞系统，该方法转译效率高，十分灵敏；但活细胞成分较多，较难纯化蛋白产物。 4. 逆转录合成双链cDNA (1)?以poly(A) RNA为模板，寡聚(dT)作引物，加入四种三磷酸脱氧核苷(dNTPs)，在逆转录酶作用下合成第一条互补DNA链，这条链在末端会弯回形成一个发夹结构； (2)?碱处理降解DNA杂交双链中的RNA模板链； (3)?以第一条链cDNA链为膜板，发夹结构作引物，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或其Klenow片段）作用下，加入四种dNTP，合成第二条DNA链； (4)?用特异切除单链的S1酶切去发夹环部分，最终得到平端ds-cDNA。 逆转录是否能形成全长cDNA取决于转录中所用的条件、模板的结构和纯度。产生各种不完全转录产物的原因可能有： (1) mRNA本身广泛的二级结构使逆转录酶难于穿越mRNA特异性区域； (2) mRNA中间存在一段特殊序列被逆转录酶当作终止信号识别，从而使逆转录中断； (3) mRNA内部存在着不同的poly(A)序列，成为不同的转录起始点，从而导致了不连续的逆转录产物； (4)?mRNA转录区互补核苷酸特别丰富，而底物dNTPs浓度过低，从而降低了酶的作用； (5)?逆转录酶制剂中含有污染的RNase，引起RNA模板降解而使产物不完全。 为了获得全长的cDNA拷贝，并提高它在总cDNA中的比例，目前主要采用四项措施： (1) 提高底物dNTPs的浓度，或加入一定量的核糖苷酸或焦磷酸钠； (2) 加入氢氧化甲基汞或解链蛋白，以打开m