传统测序和二代测序与应用.pptVIP

什么是单核苷酸多态性 人类99．9％的基因密码是相同的，而差异不到0．1％，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。 5.5 人类基因组计划的意义 　 随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就，人们的生活也将发生巨大变化。人类基因研究的意义在于它可以支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究。如基因组遗传语言的破译，基因的结构与功能关系，生命的起源和进化，细胞发育、生产、分化的分子机理，疾病发生的机理等。 7 水稻的基因组 2002年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得多。人类基因大约有3-4万个，水稻有46022-55615个基因。 本章要点 链终止法测序 人类基因组计划 了解其他基因测序方法和基因拼接方法 了解Nanopore（纳米孔）测序法。 高通量测序及应用 Degraded state of the sample ? mitDNA sequencing （线粒体） 古生物: 洞穴熊, 猛玛, 原始人(106 bp ) Roche/454 FLX: 2004 Illumina Solexa Genome Analyzer: 2006 Applied Biosystems SOLiDTM System: 2007 Helicos HeliscopeTM : recently available Pacific Biosciencies SMRT: launching 2010 成本低廉 公司能提供一条龙服务 我们的任务：如何用好这一技术？ 你们的任务：如何用好这一技术？ RNA-seq技术原理及应用 DNA芯片测序 基本原理 （1）将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置. （2）待检测的DNA分子与芯片温浴, （3）凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号, （4）然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 利用基因芯片进行杂交测序的原理 问题：所测片段较短，一般小于2kb，而基因组很大，怎么办？ 4 序列的组装 4.1 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. A B C A B C A B C A B C 小片段测序 计算机拼装 A B C 小片段测序 计算机拼装 鸟枪法(Shotgun)测序的问题 CAATGCATTA… …GCAGCCAATGC GAP 重复序列：错装 实例: 流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装 超声波打断纯化的基因组DNA ↓ 琼脂糖电泳收集1.6～2.0Kb的区段、纯化 ↓ 构建到质粒载体中 ↓ 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp ↓ 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ↓ 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ↓ ↓ 载体或宿主菌 选用不当而被丢失的顺序 测序时遗漏的测序 解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库 解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库 4.2 限制测序 限制测序：是指将一段染色体区段的DNA 顺序进行组装. 一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法. 如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序,再进行序列组装； 水稻基因组测序计划采取得策略与此相同. 4.3 Shot-gun法 建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。 在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，