表皮生长因子(egf)对体外培养食管癌细胞增殖及迁徙能力影响的初步研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

5.不同浓度 5.不同浓度 EGF 作用食管癌细胞 EC109、EC-1 后，荧光抗体标记β–actin,激光 PAGE PAGE 2 共聚焦显微镜细胞骨架光学切片观察。 6.不同浓度 EGF 处理食管癌细胞 EC109、EC-1 后，裂解细胞提取全蛋白，SDS电泳分离后，Western-blot 检测 EGFR 的表达。 [结果] 1.倒置显微镜下，低浓度 EGF 组（0.01～1ng/mL）与对照组相比细胞形态无明显 改变，细胞间排列紧密，细胞呈扁平的多角形，具有典型的上皮型细胞生长特性。 高浓度组（10～100ng/mL），EGF 作用 12h 后细胞开始变圆，贴壁能力降低；48 或 72h 后细胞呈长梭形，有较长突起，互相连接成网状，细胞之间连接不紧密， 部分细胞呈悬浮细胞生长特性，细胞呈圆形和聚集成葡萄串状。 2.MTT 实验结果发现，低浓度 EGF（0.01～0.1ng/mL）对食管癌细胞株 EC109 和 EC-1 均有轻微的抑制增殖效应，增殖活力分别为（96.9±4.0）%、（94.2±9.1）% 和（96.6±5.6）%、（93.4±8.4）%，P 值分别为 0.473、0.191 和 0.535、0.229， 差别无统计学意义；高浓度 EGF（1～100ng/mL）能显著抑制两株食管癌细胞的 增殖，增殖活力分别为（89.470.3±5.27.2）%、（70.3±5.2）%及（74.9±6.7）% 和（86.0±11.2）%、（70.9±8.4）% 及（74.0±6.6）%，P 值分别为 0.024、0.000 及 0.000 和 0.017、0.000 及 0.000，差别有统计学意义，其中 EGF 对 EC109 和 EC-1 的最大抑制效应浓度均为 10ng/ml。 3.细胞经 AO 染色后，荧光显微镜观察：高浓度 EGF（10～100ng/ml）处理的食 管癌细胞 EC109 、EC-1 呈均匀的黄绿色荧光，胞内也未出现增强的绿色荧光片 段，也未见脱落的凋亡小体。流式细胞术结果表明各实验组与空白对照组一样只 有二倍体和四倍体两个峰，无亚二倍体峰即凋亡峰出现。 4.单克隆扩散实验观察到：对照组细胞集落不断增大，细胞数增多，部分集落中 央可见肿瘤细胞堆积，无细胞迁出。低浓度组（0.01～1ng/mL）与对照组相比细 胞集落无明显变化，高浓度组（10～100ng/mL）细胞集落可见大量的细胞向集落 周边迁出，细胞成散落样分布；划痕损伤 48h 后，对照组划痕边缘较光滑，无细 胞迁出；100ng/mL 组表现为较多损伤边缘的细胞向划痕间隙迁出，迁出细胞的 伪足、极性明显。 .激光共聚焦显微镜观察到：对照组食管癌细胞β–actin 主要分布于细胞膜 下，形成细胞皮质 下，形成细胞皮质，肌动蛋白纤维与质膜平行；高浓度组食管癌细胞的长极出现 较长的应力纤维束，细胞伪足增多，在细胞伪足及变圆的细胞内有较强的红色荧 光聚集。 6. 免疫印迹结果经灰度扫描后进行图像分析和统计处理，发现 EGFR 在处理前后 的食管癌 EC109 和 EC-1 中均表达,但实验组与各对照组 EGFR 的表达差异无统计 学意义。 [结论] 1.高浓度 EGF（10～100ng/mL）能诱导食管癌细胞 EC109 和 EC-1 由扁平的多角 形上皮型细胞转变成长梭形、有较长突起的成纤维型细胞即上皮细胞-间叶样变 （EMT）。 2.较高浓度 EGＦ（10～100ng/mL）能显著抑制食管癌细胞 EC109 和 EC-1 的增殖， 其中 EGF 在 10ng/ml 时对两株细胞具有最大抑制效应。但 EGF 不能诱导食管癌细 胞发生晚期凋亡，更不具有毒性杀伤作用。 3.较高浓度 EGF 作用食管癌细胞后，细胞的迁徙和浸润能力明显增强。 4.较高浓度 EGF 能诱导肌动蛋白丝重新分布，细胞的长极出现较长的应力纤维 束，变圆的细胞内动蛋白丝分布于整个细胞内。肌动蛋白丝重排是细胞发生上皮 细胞-间叶样变和迁徙浸润能力增强的主要原因。 5.高浓度 EGF 诱导食管癌细胞肌动蛋白丝重新分布不是通过上调 EGFR 的表达来 实现的，提示 EGF 可能通过其他机制激活细胞骨架重排相关信号通路来实现的。 [关键词 ] 表皮生长因子 表皮生长因子受体 肿瘤 生长抑制 浸润迁徙 流式细胞术 细胞骨架 激光共聚焦 Epidermal Growth Factor-mediated Growth-inhibition and Migration of esophageal cancer cell lines EC109 and EC-1 in vitro Postgraduate Ping Cheng Supervisor Associate Prof. Guan