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染色体荧光原位杂交技术的原理及其应用 综述 染色体荧光原位杂交技术的原理及其应用 王全喜 (内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特010018) 核酸的分子杂交技术是目前分子生物学中最 广泛应用的技术之一,它可以鉴定核酸分子之间 的同源性,该技术是分子克隆技术的重要组成部 分.原位杂交技术(insituhybridization)是在核酸 分子杂交基础上发展起来的一门技术,染色体荧光 原位杂交技术的原位杂交不是在溶液中或在滤纸 上进行,而是在制作的载玻片上进行的. 染色体荧光原位杂交技术(FISH)是利用标 记好的DNA或RNA与细胞染色体核苷酸进行 杂交,检测后者在细胞内的存在及其数量和结构 改变的方法.单基因特殊染色体区域,整条染色 体或种特异基因组均可特异标记而显示出来.过 去探针均采用放射性物质一一同位素来进行标 记,其灵敏度虽然较高,但有几个主要缺点:实验 周期长;背影深;分析复杂;放射性探针不稳定; 污染环境,对人体健康不利等¨..荧光(非放射 性)原位杂交正是弥补了以上的缺点.与放射性 标记相比,非放射性标记具有以下优点:①用荧 摘要:荧光原住杂交是现代分子生物学及 基因工程中广泛应用的新技术,它可以鉴 定核酸分子之间的同源性.原位杂交技术 是在核酸分子杂交基础上发展起来的一 门技术,染色体荧光原位杂交技术是随着 绘制高分辨人类基因组图谱需求而出现 的.笔者综述了染色体荧光原位杂交技术 的原理,方法,并分析了其应用前景. 关键词:染色体;核酸杂交;原位杂交;探针 中图分类号:Q813.4文献标识码:A 文章顺序编号:1672—5190(2o05)03-003 1FISH的基本原理和方法 从DNA的结构可以得知,DNA为双链双螺旋 分子,其中一条链与另一条链的核苷酸序列互补. 因此,两条来源不同的具有核苷酸互补关系的单 链DNA(或一条DNA和一条RNA)在去掉变性条 件后互补的区段能够逐步形成双链DNA(或DNA 和RNA杂交)分子|4].一个探针本身是一个具有特 定序列的DNA或RNA片段,它能作为DNA分子 中某一序列的补充物.靶DNA序列中有其互补序 列会在适当的条件下进行结合(杂交).荧光原位 杂交就是利用这一原理将标记探针同组织细胞或 染色体DAN进行分子杂交,经荧光检测体系对待 测核酸进行各种分析. 1.1探针选择:常用的探针是染色体特异性的重 复DNA序列,这些序列定位于染色体的着丝粒或 端粒,主要用于快速检测染色体单体和三倍体.还 有一种常规探针是从基因组DNA文库中分离出 来的全长染色体探针,用于染色体的异位或畸变. 1.2探针标记:探针标记有直接和间接2种标记 法.直接标记法是将荧光物直接标记核苷酸上.间 接标记方法是先在DNA探针上接半抗原物,镜检 时再用能与半抗原特异结合的蛋白质进行检测. 探针的标记方法有缺口平移,随机引物延伸,体外 转录和PCR扩增等几种方法. 1.3变性和杂交:杂交前首先双链探针DNA和染 色体DNA进行变性,温度和时间随着探针类 型而变化.杂交在染色体制片上进行,杂交液浓 度,pH值,杂交温度等随着探针DNA和染色体 DNA最适退火条件而变化. 1.4显色和检测:检测方法也有直接和间接之分, 如果探针用直接方法标记的可直接在荧光显微镜 下观察,如果探针用间接方法标记的必须通过问 接免疫荧光法进行检测. 2染色体FISH的应用 2.1在医学上的应用:人类有许多遗传病和恶性 肿瘤是染色体结构和数目畸变引起的,因而无法 用常规的细胞遗传学方法进行鉴定.而FISH的建 立,不仅能为易位性重排,而且能为重复,缺失或 插入性重排确定其重排类型,来源和断裂点提供 可靠的证据,因而在基因诊断和肿瘤分析方面具 有重要意义. 2.1.1在临床和肿瘤细胞遗传学中的应用:用染 色体涂色或着丝粒特异性探针很容易确定人类染 色体数目的异常,如X,Y,21,18,13号染色体的 异常].在肿瘤细胞遗传学研究中,异倍体和多倍 体实属常见,而中期分裂相又难获得,FISH更能 显示它的不凡之处.在染色体结构异常的诊断研 究中,也能提供最可靠的依据,FISH也是鉴别一 些环状染色体或在额外小染色体研究中提供最可 信的方法_6]. 2.1.2在基因诊断中的应用:某些遗传疾病,311: Duchenne/Becker肌营养不良,Miller-Dieker综合症 和DiGeorge综合症等,大多数都是因为染色体微小 缺失而引起的,这些病用高分辨染色体或RFLP分 析方法都很难观察到,而用FISH就很容易观察到. 同样FISH可用于基因重复性遗传病,如Charcot— Marie—Tooth病,在17号染色体上出现PMP一22基 因双重杂交信号.应用Y一特异性DNA探针,包括 新近分离的SRY基因,能够通过FISH方