地中海富盐菌PhaE蛋白乙酰化修饰对其功能的影响-微生物学报.PDFVIP

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2017, 57(11): 1665-1675 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Epigenetic Modification 表观遗传修饰 地中海富盐菌 PhaE 蛋白乙酰化修饰对其功能的影响 1,2 1 1 1 1* 1,2* 姜雄健 ，王前 ，刘桂明 ，赵大贺 ，刘景芳 ，向华 1 中国科学院微生物研究所，微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100101 2 中国科学院大学生命科学学院，北京 100049 摘要：【目的】研究地中海富盐菌PHA 合酶(PhaEC) 中 PhaE 亚基乙酰化修饰对其功能的影响，探讨乙酰 化修饰对菌体生理代谢的调控作用。【方法】蔗糖密度梯度离心收集PHA 颗粒，质谱鉴定颗粒结合蛋白 PhaE 的乙酰化位点。将乙酰化位点(赖氨酸，K)分别突变为精氨酸(R)(模拟去乙酰化)或谷氨酰胺(Q)(模 拟乙酰化) ，利用同源双交换原理，将突变后的基因原位敲入基因组。以野生型为对照，检测突变对菌 体生长、葡萄糖消耗和 PHA 合成能力的影响。利用 Western blot 检测 PHA 颗粒上 PhaE 的含量，进一 步分析乙酰化修饰对蛋白功能的影响。【结果】在PhaE 蛋白 105 位和 170 位赖氨酸(K) 2 个位点检测到 乙酰化修饰。利用遗传操作系统将突变的基因原位敲入，共得到 6 种突变株。发酵结果表明，任何一种 单突变对菌体生长及 PHA 合成的影响均不明显。但当 2 个位点同时突变成精氨酸(K105R/K170R)时， 突变株生长及合成 PHA 的能力均受到明显抑制，2 个位点同时突变成谷氨酰胺(K105Q/K170Q)则无明 显影响。进一步的 Western blot 结果表明，突变成精氨酸的双突变株的 PHA 颗粒上，PhaE 蛋白的含量 相较于野生型约降低了一半。【结论】PhaE 蛋白的去乙酰化能够导致菌株利用葡萄糖合成 PHA 的能力 显著降低，其可能原因是降低了 PhaE 与 PHA 颗粒或 PHA 颗粒上 PhaC 的结合能力，从而降低了 PhaEC 合酶的活性。 关键词：乙酰化，PHA 合酶，PhaE ，突变，嗜盐古菌 蛋白质翻译后修饰，是指 mRNA 被翻译成蛋 /docs/ptmlist) ，随着技术进步，越 白质后，蛋白质上个别氨基酸残基被共价修饰的 来越多的修饰种类被发现。其中研究较多的包括 过程。它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完 磷酸化、甲基化、泛素化、糖基化、乙酰化、琥 善，调节更为精细，作用更为专一[1] 。迄今为止， 珀酰化、亚硝基化等。早在 20 世纪 60 年代，真核 已有 400 多种蛋白质翻译后修饰被发现 (http:// 生物组蛋白 N 末端赖氨酸乙酰化现象已被发现[2] 。 基金项目：国家自然科学基金 ；食品科学与工程浙江省重中之重一级学科开放基金(YTs *通信作者。刘景芳，Tel ：+86-10，E-mail ：liujf@ ；向华，Tel/Fax ：+86-10，E-mail ：xiangh@ 收稿日期：2017-01-23 ；修回日期：2017-03-01 ；网络出版日期：2017-03-29 1666 Xiongjian Jiang et al. | Acta Microbiologica Sinica , 2017, 57(11) 但直到 21 世纪初，这种修饰才引起人们的广泛关 因簇(phaJ-phaR-phaP-phaE-phaC ) 。其中，PhaP 是 注。乙酰化主要发生在赖氨酸残基上，根据修饰 PHA 颗粒的主要结构蛋白，PhaR 是调控蛋白，它