美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆表达及酶学性质.PDF

中国农业科学 2017,50(5):849-858 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.008 美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质 1 1 1,2 1 1 1 1 闫晓平 ，赵丹 ，郭巍 ，王伟 ，张雅昆 ，郜玉杰 ，赵坤莉 1 2 （河北农业大学植物保护学院，河北保定071000 ； 北京农学院植物科学技术学院，北京102206） 摘要：【目的】研究美国白蛾（ Hyphantria cunea ）几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）基因的酶 学性质，了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能，为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】 对家蚕（ Bombyx mori ）、棉铃虫（Helicoverpa armigera ）和云杉卷夜蛾（Choristoneura fumiferana ）3种鳞翅目昆虫的几丁质 脱乙酰酶 2 序列保守域进行分析，采用同源比对方法，设计几丁质脱乙酰酶 2 基因特异引物，利用 PCR 扩增该基 因全长 cDNA 序列；构建原核重组表达载体 pET30a-HcCDA2，克隆获得编码美国白蛾 HcCDA2 的基因，IPTG 诱导 蛋白表达，SDS电泳检测；构建重组杆状病毒表达载体 pFastBac-HcCDA1 和 pFastBac-HcCDA2，脂质体转 染法转染昆虫细胞 Hi5，分别获得 P1、P2、P3 病毒，收集 P3 病毒上清，得到美国白蛾 HcCDA1（前期研究所得） 和 HcCDA2 重组蛋白，Western blot 分析；重组蛋白 HcCDA1 和 HcCDA2 经硫酸铵粗纯化后，以对硝基乙酰苯胺 为底物，测定重组几丁质脱乙酰酶 HcCDA12 的酶活力，对其最适反应温度、最适 pH 以及金属离子的影响等酶 学性质进行研究。【结果】 获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶 2 基因全长 cDNA 序列，命名为 HcCDA2 (GenBank 登录号：KT781841)，基因全长 1.6 kb，该基因在大肠杆菌中成功表达 61 kD 目的蛋白，免疫家兔获得 HcCDA2 蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot 分析结果表明，HcCDA1 和 HcCDA2 在昆虫细胞（Hi5）中均成功表达约 80 kD 蛋白。酶学性质研究表明，昆虫细胞中分泌表达的 HcCDA1 和 HcCDA2 均具有催化活性，两种酶的最适反 应温度均为 50℃，当温度达到 80℃时，HcCDA2 几乎失去酶活力；HcCDA1 酶促反应适宜的 pH 范围为 7.0—9.0， 并且 HcCDA1 和 HcCDA2 酶促反应的最适 pH 均为 8.0；在最适反应条件下，HcCDA2 蛋白酶活力均高于 HcCDA1 蛋 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 白酶活力；Mg 、Zn 、Mn 和 Ca 对 HcCDA1 和 HcCDA2 酶促反应整体呈抑制趋势，随浓度增大，Zn 对 HcCDA1 抑 制作用逐渐增强，而 Mg2+ 2+ 2+ 对 HcCDA1 的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势，而且 Mg 和 Ca 对 HcCDA2 的抑制作 用也