PCR技术及其发展和应用（PPT 104页）培训讲学.ppt

三、实时荧光PCR技术 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程； 结合相应的软 件可以对结果 进行分析，计 算待测样品的 初始模板量。 如何定量？ Ct值的概念 Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 为什么要用Ct值定量 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 C(t)值的重现性 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性 荧光强度循环数曲线 初始模板量对数C(T)循环数标准曲线 104 103 106 105 102 10 C(t)与初始模板含量 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系 定量原理 初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值） Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 确定初始模板的浓度 1、荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I 1）内掺式染料 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I 优点 使用方便 不必设计复杂的引物 没有序列特异性 可以用于不同的模板 便宜 灵敏 例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平 方法流程： 1、标准品制备：普通PCR扩增出comE基因片断→装入克隆质粒→定量稀释为109拷贝作为标准品备用 2、定量检测comE基因表达水平：提取RNA→逆转录成cDNA→与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板，同时进行荧光定量PCR→根据实验数据分析结果→得到其表达的绝对量。 图1 comE基因荧光定量PCR扩增曲线 图2 comE基因荧光定量PCR融解曲线 表1 D39菌株在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达 批 次 comE/16SrRNA 0min 10min* 20min 1 0.0341 0.9520 0.0402 2 0.1974 1.2047 0.1112 3 0.0124 0.4073 0.0160 *：p0.05，CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高 实验结果： Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） 2）序列特异性探针 双标记探针（Taqman Probe） 优点 对目标序列有很高的特异性 特别适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比设计相对简单 是目前应用最广泛的一种技术 T A C C G G G G G T T A C G A A C G G T A A T G A T C C T A C C G A T C C C A C C SNP检测 R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 分子信标（Molecular Beacon Probe） 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ R Q 5’ R Q R Q 3’ 5’ Q R R R Emission Excitation Q R 引物特异性探针（Amplifluor Probe） 3）引物特异性探针 2、荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 灵敏度高 灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高 特异性高 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 定量准确 全程监控，准确的算法进行定量 无需跑胶，自动化程度高 3. 得到的引物结果 Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构 Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体 False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对 Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体 正向和反向引物的互换 正向和反向引物的评价 正向和反向引物的信息 每点击左边红色的按钮，就出现相应的内容