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质粒dna的提取实验报告思考题 篇一：质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题　　1．实验目的：　　（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；　　（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 　　2．实验材料及用品 　　（1）实验仪器（apparatus）： 　　恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒 （graduated cylinder）、 玻璃棒（stir bar）、 微波炉（microwave）、 天平（Pan balance）、电泳梳子（ comb）、电泳槽 （electrophoresis tank）、 电泳器 （Electro-phoresis System）、 紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）  　　3）、材料与试剂（Reagents）： 　　①溶液I（Solution Ⅰ）：　　50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0　　溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 　　②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合 　　0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 　　③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 　　60mL5mol/L KAc，　　11.5mL 冰醋酸，　　28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L） 　　④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0） 　　⑤70% 乙醇；　　⑥平衡酚：氯仿 1：1：　　将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。　　⑦LB培养基：　　胰化蛋白胨 10g　　酵母提取物 5g　　NaCl 15g　　pH 7.0　　⑧琼脂糖（Agarose）；　　⑨1 liter（升）5×TBE备用溶液（stock solution）：　　54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0；　　⑩6×凝胶加样缓冲液：　　0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue），40% 蔗糖（sucrose in water）；　　另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview试剂 　　（2）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。 　　3．实验原理：　　1）质粒DNA的提取：　　（1）关于质粒：　　质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。　　（2）一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：　　①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；　　②收集和裂解细菌；　　③分离和纯化质粒DNA。　　分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。　　（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：　　碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。　　在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至