多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达-预防兽医学专业论文.docxVIP

!lO14111也 摘要 脑多头蝴病是由多头带缘虫 (Teania Multiceps) 的中缭期幼虫脑多头蝴 (Coenurus cerebralis) 寄生于绵羊、山羊和牛等动物脑、脊髓内引起的一种严 意致死性人兽共患病。该病是全球性分布，在我国主要以西北等牧区常见，给 商牧业造成巨大的经济损失。目前本病的诊断主要是靠典型的临床症状，若能 找到一种敏感性和特异性较好的抗原用于诊断，则对于脑多头蝴病的预防和治 疗有非常重要的意义。 本试验从脑多头拗的原头拗中提取出总 RNA ，参照已报道的猪囊尾蝴诊断 抗原 NC-3 基因 (AJ012669) 设计了一对特异性引物，应用反转录.聚合酶链反 应 (R下PCR) 技术，扩增出了一条约 400bp 的片段。测序结果显示丁m7 基因与 NC-3 基因的相似性为 97%，阳与细粒棘球练虫EpCl 基因 (AF481884) 有 83% 的相似性。本序列包含 NC-3 基因完整的开放阅读框和 EpCl 基囚的部分开放阅 读框，编码由 68 个氨基酸组成的蛋白质，软件分析表明该蛋白质的分子量为约 7.6k.Da，等电点理论值为4.52 ，有较强的来水性。 用 EcoR 1 和 XhoI 双酶切将丁m7 基因从 pMDt8-T 载体七切下，插入原核 表达载体 pET32a(吟，得到重组质粒 pET32a(吟-Tm7，将其转入表达菌大肠杆菌 BL21 (DE3) 中， IPTG 诱导表达。 SDS分析表明，在相对分子质量约 27k.Da 处可见目的基因与表达载体的融合蛋白，而对照组 pET32a(+) 空质粒菌在 此处没有条带。该蛋白在 IPTG 浓度为 0.25mmollL时于 37.C 诱导表达 4h 达到 表达最的最大值。经 Ni-亲和层析柱纯化后，得到纯度较高的重组蛋白。免疫印 迹试验表明，羊脑多头拗病阳性血清能够识别该抗原，说明震组蛋白有反应原 性。 以多头带缭虫重组蛋白 Tm7 作为包被抗原，学脑多头蝴病阳性血清作为一 抗，用 HRP 标记的兔抗羊 IgG (HR扣兔抗羊 IgG) 为酶标二抗作间接 ELISA 来 检测羊血清中的脑多头蝴抗体。通过对抗原包被浓度、抗体稀释度、工抗浓度、 各步骤作用时间等的摸索，得出了最组抗原最适包被浓度为 2.5μg/时，血清稀 释度为 1:40，一抗最佳反应时间为lh，酶标二抗工作浓度为1:5000，反应时间 为 37.C45min ，底物37.C 显色 15mino 采用巳确立的 ELISA 反应条件，检测了 12 份阴性羊的血清，依据阴阳临界值=阴性血清 OD 平均值十2SD ，确定阴阳临 11 11 界值为 0几用此方法检测 15 份确珍为脑多头蝴病的羊血清，仪布 1 份 OD 值 低于临界值，敏感性为 93.3%;对 12 份阴性加清检测，均低于临界值，对 5 份 细颈囊尾蝴病血清检测，有 1 例高于临界值。初步证明堕组 Tm7 抗原有作为诊 断抗原的潜力。 关键诩:脑多头拗:重组抗原; Tm7; ELISà Cloning and prokaryotic exprω sion of Taenül multiceps Tm7 gene from protoscolex An xiaoxue (Preventive Vetrinary Medicine) Directed by professor Yang Guangyou (Departrnent ofParasitology，College ofVeterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Yaan， Sichuan，625014) Abs柑3d: Cerebral coenurosis or，more appropriately，central ne凹ous system coenurosis ( CNSc )， is caused by infection with 由e larval stage (Coenurus cerebralis) ofTaenia multiceps. ηle 创ult worm inhabits the small intestine of 呐ld and domestic canids with dogs 掘出emost 企equent defmitive hosts，while the larval stage develops in the ce附al nervous system of sheep and other ungulates. Coenurosis has been documented in sc矶时ed foci