产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽研究-微生物学专业论文.docxVIP

产朊假丝酵 产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽研究 中文摘要 I I PAGE PAGE IV 中文摘要 谷胱甘肽（GSH）是生物体内一种重要的含硫生物活性小分子化合物，它由 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成，在活细胞内具有抗氧化、清除自由基、提 高机体免疫力和解毒等生理功能。近年来，随着研究的不断深入，GSH 在食品、 保健品、医药、体育运动、动物生产等诸多领域都具有广泛的应用。 全细胞生物转化具有转化效率高，催化专一性强，反应条件温和等优点，因 此可以采用此法合成 GSH。本论文以产朊假丝酵母（Candida utilis SZU 07-01）为 出发菌株，以实现 GSH 转化的高产量、高得率为目标进行研究，主要内容包括三 个方面：首先利用基因组改组（Genome shuffling）技术选育高性能菌株，提高其 胞内 GSH 合成酶系的表达水平；其次应用统计学方法对微生物培养条件、转化液 中各前体氨基酸的比例以及转化培养环境参数进行优化；最后考察表面活性剂对 酵母细胞合成 GSH 能力的影响及其作用机制。主要研究结果如下： （1）对出发菌株 C. utilis SZU 07-01 采用亚硝基胍诱变，再经过 2 轮 Genome shuffling 递归融合，并通过选择培养基（含 2.0 g/L 乙硫氨酸，1.2 g/L NaHSO3）进 行筛选，最终获得一株 GSH 合成能力显著提高的菌株 F2-32，经过分批发酵验证， 其胞内 GSH 含量达到 2.8%，比出发菌株提高了 64.2%。为下一步利用该菌株进行 全细胞生物转化合成 GSH 奠定了良好基础。 （2）采用单因素试验和响应面分析等实验设计方法，对培养 F2-32 的种子培 养基成分进行优化，以获得最高 GSH 转化力为目标，得出最适的种子培养基成分 为：葡萄糖 58.5 g/L、蛋白胨 25 g/L、酵母粉 10 g/L、KH2PO4 17.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L 和 pH 6.0。在该培养基条件下，GSH 转化力平均为 1.54 mg/g/h，比营养 条件优化前提高了将近 1 倍。其次，采用正交试验设计对转化液体系中各反应物 组分进行优化，得到的最优组合是：半胱氨酸 20 mmol/L、谷氨酸 40 mmol/L、甘 氨酸 40 mmol/L、MgCl2·6H2O 40 mmol/L 和 ATP 20 mmol/L，在该转化液体系下， 胞内 GSH 产量达 198.2 mg/L，比优化前提高了 23.0%。最后，在培养基和转化液 体系优化的基础上，通过对胞内 GSH 合成和糖酵解过程中的关键酶以及能量代谢 物质进行分析，发现葡萄糖作为能量物质代替 ATP 是切实可行的，转化液中葡糖 中文摘要 产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽研究 糖的最适浓度为 40 g/L。 （3）考察了六种表面活性剂在 GSH 转化中的作用，结果显示 SDS 对 GSH 胞 外积累具有积极作用，随着 SDS 的增加胞外 GSH 含量不断上升，但 GSH 总量呈 抛物线，当 SDS 添加量为 0.15 g/L 时，胞外 GSH 含量为 135 mg/L ，GSH 总量达 到最大为 235 mg/L。对 SDS 促进 GSH 胞外分泌的作用机理进行了进一步分析， 采用透射电镜对不同作用时间下的细胞进行观察，发现适宜的 SDS 浓度可以在不 破坏细胞性能的情况下增加了细胞膜的通透性。通过对胞内 γ-GCS 的酶活进行测 定，发现适量 SDS 的添加提高了 γ-GCS 的活性，这一结果也从侧面反映了 SDS 的作用，即通过增加细胞膜的通透性，使 GSH 向胞外分泌，从而解除了胞内 GSH 的反馈抑制作用，增加 GSH 合成量。对胞内能量代谢物质水平进行分析，发现 SDS 对细胞的能量代谢没有显著影响。这些研究结果为进一步提高 GSH 生物合成能力 提供了理论参考。 关键词：产朊假丝酵母；谷胱甘肽；Genome shuffling；全细胞转化；表面活 性剂 作 者：朱健 指导教师：卫功元 产朊假丝酵 产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽研究 英文摘要 Strategies on enhanced glutathione production by bioconversion using Candida utilis as a whole-cell catalyst Abstract Glutathione （GSH）, an active small molecule have high biomedical value in vivo, is a dehydration condensation tripeptide of glutamate, cysteine,