产气荚膜梭菌α、ε毒素突变体构建及应用微生物学专业论文.docxVIP

安徽 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 A absorbance 吸光值 Amp ampicillin 氨苄青霉素 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 bp base pair 碱基对 Da dalton 道尔顿 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 E.coli Escherichia coli 大肠杆菌 HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 CT50 IPTG 50% cytotoxic concentration Isopropyl β-D-1-thiogalacoside 半数细胞致死浓度 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 IgY Immunoglobulin of egg yolk 卵黄免疫球蛋白 LB Luria-Bertani medium Luria-Bertani 培养基 LD50 MTS 50% lethal dose 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetr 半数致死剂量 四氮唑化合物 mETX azolium mutant epsilon toxin 产气荚膜梭菌 ε 毒素突变体 mCPA mutant alpha toxin 产气荚膜梭菌 α 毒素突变体 PCR Polymersase chain reaction 聚合酶链式反应 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 rETX recombinant epsilon toxin 重组产气荚膜梭菌 ε 毒素 rCPA recombinant alpha toxin 重组产气荚膜梭菌 α 毒素 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 Trx thioredoxin 硫氧还蛋白 摘要 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）根据其产生的主要的四种外毒素 α、β、ε、 ι 可分为 A、B、C、D、E 五种型。各型产气荚膜梭菌均可产生 α 毒素（CPA），但其 主要由 A 型产气荚膜梭菌产生，产气荚膜梭菌 α 毒素具有磷脂酶 C、鞘磷脂酶及溶血活 性，可引起人畜的气性坏疽和人类的食物中毒等疾病；产气荚膜梭菌 ε 毒素（ETX）由 B 型和 D 型产气荚膜梭菌产生，具有神经毒性、肠坏死性等致死活性，可导致山羊、绵 羊等的致死性肠道疾病，如肠毒血症和坏死性肠炎。鉴于产气荚膜梭菌 α 毒素和 ε 毒素 的强致死性，所以作为重要的生物毒素战剂及潜在的生物恐怖剂，被列入生物两用品进 出口管制清单，因此发展有效应对两种毒素的疫苗或抗体则显得尤为重要。 本研究通过构建 ETX 突变体（mETX）及 CPA 突变体（mCPA），实现其在原核表 达系统中的可溶性表达及纯化，并鉴定其抗原性及生物学活性，筛选出有效的候选抗原， 最终制备 mETX 候选疫苗及 mCPA 卵黄抗体。 首先， 通 过 定 点 突 变 的 方 法 构 建 mETX 重 组 表 达 质 粒 (pTIG-mETXH106P ， pTIG-mETXS111H ， pTIG-mETXS111Y ， pTIG-mETXF199H ， pTIG-mETXF199E ， pTIG-mETXS111YF199E)，并转化至 E.coli BL21(DE3)细胞中，通过 PCR、双酶切及测序鉴 定确认序列正确。扩大培养重组表达工程菌，经 0.5mM IPTG 16℃过夜诱导表达，用螯 合有 Ni2+的亲和层析柱进行纯化。得到的 mETX 对其活性及抗原性进行鉴定，用 MTS 法染色分析，计算 mETX 对 MDCK 细胞的半数致死剂量（CT50）并与重组野生型 ETX 的 CT50 进行比较，分析其统计学差异。筛选出无毒或低毒性的突变体 mETXH106P 和 mETXF199E 与铝佐剂充分混匀后分别免疫 Balb/c 小鼠，免疫后用间接 ELISA 方法检测血 清抗体效价，最后一次免疫后一周用有活性的重组 ETX 对健康小鼠进行攻毒试验，并 收集血清与有活性的重组 ETX 在进行体外中和试验，观察保护效果。 其次， 通 过 定 点 突 变 的 方 法 构 建 mCPA 重组表达质粒（ pTIG-mCPAD56S ， pTIG-mCPAH68S），并转化至 E.coli Origami 表达感受态中，经过 PCR、