产精氨酸脱亚胺酶变形假单胞菌的筛选鉴定及酶的定向改造-发酵工程专业论文.docx

Mm川叫啼 ，州川川 Mm川叫啼 ， 州川川咱 ， mwa川JW M明明 明 A1· 州附s m川n川o m州阳咽a ， 州 州州Va 摘要 精氨酸脱亚版酶(Ar ginine deiminase ，ADJ ，巴C3.5.3而)，属于一类称为肌基修饰 酶总科，催化精氨酸产生瓜氨酸和氮。该酶广泛存在于多种微生物中，但哺乳类动物 细胞中没有该种酶。因其具有的成为精氨酸缺陷型肿瘤如肝细胞瘤、黑色素瘤抗癌药物 的巨大潜力而被研究。 肝细胞癌是现在世界上病发率最高的癌症之一，每年新增一百万病例。近年来，精 氨酸脱亚版酶 (ADI)的抗癌活性在国际上受到关注。美国食品药品管理局 (FDA) ，欧洲药 品审评署(EMEA)分别于 1999 年及 2005 年通过 AD卜PEG♂0 作为罕见病药物用于泊疗 黑素瘤，肝细胞癌，目前二期|临床正在进行中。本研究室通过筛选鉴定 ADI 产生菌株， 并对该酶进行定向改造以改良其在体内生理条件下的酶活和隅学性质，为开发具有自主 知识产权的抗癌新药提供酶源。 通过建立…种 ADI 产生菌的筛选方法，得到一株产 ADI 的菌株 SWPl 。对该菌进行 形态、生理生化特征鉴定和 168 r时 A 基因序列分析，鉴定该商为变形假单胞菌。 i在菌 现保藏于中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通辙生物保般中心，保存号 CGMCC No.2039 ，并已申请专利(一株产精氨酸脱亚版酶菌株及其应用，专利号: 200710107822.X) 。 构建ADI编码基因αrcA的重组表达载体pET2钮-ADI ，在大肠籽1摘自L21(DE3) 中获得 高效表达。通过对诱导表达条件的优化，确定在 OD600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基 -?-D-硫代半乳糖背IPTG) ，30 ?C 诱导4h时酶活最高，为 2.04 U/mL发酵液。重组精 氨酸脱亚版酶 (rADI)经离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到电泳纯的 rADlo 比酶活为 20.85 U/mg (pH 6.0，37 0C)，Km 为2.88 mmol/L Vmax 为31.68μmol/minlmg ，最适反@pH 6.0 。经凝胶过滤分析，该酶分子最为92.6kDa ，SD8电泳显示ADI 条带大小为 46 kDa，说明重组精氨酸脱亚版幅为问源二聚体。 研究表明，来源于变形假单胞菌 Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039 的重组 ADI 的最适反应 pH 为 6.0 ，在pH 7.4 (人体内生理 pH 在 7.4左右)时残余酶活降低至 10% 以下:其 Km (2.88 mmol/L pH6.0) ，高于人血清精氨酸浓度(100-120μM) 20 倍 以上。因此，该精氨酸脱亚肢酶的高 Km 值及生理 pH 条件下酶活较低的性质成为该酶抗 癌活性研究的限制性因素。定向进化技术是改造分子朝既定目标进化的有力手段。基于 改良的二乙瞅→脂硫版服(测定瓜氨酸)方法，建立了简便灵敏的 96 孔板高遇最筛 模型，用于获得生理 pH 条件下具有高酶活和低 Km 值的精氨酸脱亚版酶。通过一轮易错 PCR ，从650 个突变株中筛选获得一株优良的突变株 M314 ，其生理pH 条件下比酶活 (9.02 U/mg)较出发前株(0.44 U/mg)提高 20 倍以上 ，Km 值下降至 0.65 mmol/L (pH 7.4)，最适 pH 从 6.0 提高至 6.50 M314 携带的三个突变位点分别为 A128丁， H404民和 I410L 通过 蛋白质问源建模分析了各突变位点在蛋白质结构和活性中的作用。 11 11 江南大学博才?学位论文 关键词:精氨酸脱亚版酶:筛选:鉴定:表达:纯化;定向进化:变形假单胞菌: 肿瘤 Abstract Abstract Arginine deiminase (ADI; EC ) belongs to a guanidine group-modifying enzyme superfamily and catalyzes the irreversible hydrolysis of arginine to citrulline and ammonia， is expressed in microorganisms ，but not in mammalian cells. It has been studied 部 a potential anti-cancer agent for inhibiting arginine-auxotrophic tumors，such as melanomas and hepatocellular ca