上DNA-北京大学生命科学学院.PPT

设计合成了12种由11个或12个连续的脱氧胸苷酸加上两个3‘-端锚定脱氧核苷酸组成的3引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。每一种人工合成的寡核苷酸引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂合分子。 从一对不同的组织或器官中分离总mRNA，分别称为A组和B组。 ? 图5-29 DDRT-PCR反应的基本程序。 cDNA差示分析法 (RDA, Representation Difference Analysis) 通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。 4碱基切割酶处理Tester和Driver，形成平均为256 bp的代表群，保留了绝大部分遗传信息。 每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度高。 Gateway大规模克隆技术 Gateway技术利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。 Gateway大规模克隆策略 TOPO反应: 将目的基因PCR产物连入Entry载体。载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。5’GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。 LR反应： 将目的片段从Entry 载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。 基因的图位克隆法 (Map-based cloning) 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 图5-26 染色体步移法克隆基因示意图 在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥中，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。 用图位克隆法获得水稻脆杆基因BCL 将BCL定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间； B. 覆盖BCL位点的BAC大片段。 C. BCL位点的精细定位。BCL位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。 D. BCL基因结构。红色为编码区，白色为5’和3’非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。 Kosambi函数 r: 重组率 d: 遗传距离 热不对称交错多聚酶链式反应克隆T-DNA插入位点侧翼序列 TAIL-PCR：Thermal Asymmetric Inter-Laced PCR 常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列，这就需要应用反向PCR（reverse PCR）技术。 用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA； 产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过2~3kb，经连接后重新环化； 按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指。 反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。 实验中常用热不对称交错多聚酶链式反应（TAIL-PCR：Thermal Asymmetric Inter-Laced PCR）扩增T-DNA插入位点侧翼序列，获得转基因植物插入位点特异性分子证据。 TAIL-PCR使用一套巢式（nested）特异引物（T-DNA边界引物，TR）和一个短的随机简并引物（AD）。 第一轮反应（Primary reaction）是TAIL-PCR的重要环节，先进行5轮高严谨性循环，特异性引物与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增。 大幅度降低退火温度，使AD及TR均与模板DNA相结合，指数扩增一个循环。 此后，两个高严谨、一个低严谨循环交替进行（PCRII），共15个循环。特异性序列（两端分别拥有TR1和AD序列）和非特异性序列I（只有TR1，没有AD序列）大大超过非特异性序列II （两端均为AD序列）。 PCRII中，特异性序列再次被优先扩增，经稀释的非特异性序列