分子生物学研究方法和技术 教学演示课件.pptVIP

. . 7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理8、 加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。 9、 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。 . 1.1.2 1.1.3 三大原则 分子生物学研究的三大主要领域 分子生物学发展的大支撑学科之一 分子生物学发展的大支撑学科之二 分子生物学发展的大支撑学科之三 1.3 . 21世纪分子生物学展望 1.3.2 未来生物学形成的新热点及领域 1.3.2 未来生物学形成的新热点及领域 分子细胞生物学(Molecular Cell Biology) 1.1.4. . 0.5M EDTA的配制： 在700ML双蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH调PH8.0（1000ML 0．5M EDTA需加入20克NaOH），补加双蒸水至1升。 . TLE缓冲液平衡酚 TLE溶液: 0.2mol/L?Tris 0.1mol/L LiCL 5mmol/L EDTA 用HCL调PH至8.2，用等体积的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次 . 氯仿：异戍醇（24：1） 8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC处理，焦碳酸二乙酯） 3MOL/L乙酸钠（DEPC处理），将408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸调PH5.2，补加水至1升95%乙醇DEPC处理水 . 试验步骤： 1、 用液氮冷却研钵，取15g低温冷冻的植物组织，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即转移到一个盛有150ML研磨缓冲液和50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml离心管中。 2、 加入50ml氯仿：异戍醇，于50℃加热20 min 。18000g, 4℃，离心20 min。 . 3、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml，混匀，再加入50ml氯仿：异戍醇，18000g, 4℃，离心20 min。 . 4、用 TLE缓冲液平衡酚抽提水相，直至两面相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。 5、 吸取上清液，加1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，4℃沉淀过夜，然后15000g，4℃， 离心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液冲洗。 6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，于 4℃深沉RNA两小时以上。 . 7、 15000g，4℃， 离心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液冲洗，重溶于2ml双蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸钠溶液和5.5ml无水乙醇，-20℃沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。 8、18000g, 4℃，离心15min，沉淀用1ml双蒸水溶解，取10 ul稀释至1ml测OD260和OD280 . Trizol试剂盒方法 原 理 本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。 . 实验步骤 1．取50毫克植物细嫩组织，加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。 2．22℃，静置5min。 3．加入氯仿0.2ml，颠倒15s。 4．22℃，静置3min。 5．离心：4℃×15000转/分×15min。 6．取上清液0.45ml。 7．加入0.45ml异丙醇，混匀。 . 8．22℃，静置10min。 9．离心：4℃×15000转/分×10min。 10．弃上液。 11．加入1ml 4℃ 75%乙醇。 12．离心：4℃×10000转/分×5min。 13．弃上液，真空干燥5min。 14．用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。 15．紫外分光光度计测定RNA的含量： . 取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水1ml，充分混匀。与蒸镏水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算： OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下： 样本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000 当OD值260/2801.8时，提示有蛋白或酚的污染。 . 实验结果 得到比较纯净的植物组织总RNA。 分光光度