细菌内毒素电化学生物传感器的构建及性能表征-ChinaXiv.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（８）： 细菌内毒素电化学生物传感器的构建及性能表征 易　喻　王敏君　梅建凤　陈建澍　张彦璐　应国清 （浙江工业大学药学院　杭州　３１００１４） 摘要　细菌内毒素为外源性致热源，内毒素的检测在生物制品生产过程中至关重要。本研究构 建了一种用于检测细菌内毒素的电化学核酸适体生物传感器，以氨基修饰的内毒素核酸适体 ＥＡＱ２为配体，通过３巯基丙酸（ＭＰＡ）中间连接物，固定修饰在金电极表面，并通过循环伏安 （ＣＶ）和电化学交流阻抗谱（ＥＩＳ）两种方式共同表征了生物传感器的构建过程。结果发现 ＭＰＡ 1组装时间在６ｈ时能在金电极表面形成稳定的自组装单分子层。构建的生物传感器检测限达０． v００１ＥＵ／ｍＬ，低于目前报道的其他内毒素检测方法的检测限，在０．００１０．１ＥＵ／ｍＬ内毒素浓度范 3 0围内具有较好的线性关系，相关系数 Ｒ２＝０．９８７８，在实际生物样品的检测上具有一定的应用前 0景。 0 0关键词　核酸适体　内毒素　生物传感器 . 6中图分类号　 0 7 　　细菌内毒素是ＲｉｃｈａｒｄＰｆｅｉｆｆｅｒ在１８９２１８９５年间从 报道。 1 热灭活的霍乱弧菌（Ｖｉｈｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）溶解物中发现 　　本文构建的电化学核酸适体生物传感器是以核酸 0 ［１］ 2 的 。检测和分离非肠道用药品尤其是注射针剂中的 适体作为识别元件（敏感元件），将己知序列的核酸适 : v ［２］ ［１１］ 细菌内毒素成了生产工艺中的重要环节 。目前，用 配体 ＥＡＱ２ 作为探针，根据电化学信号变化检测细 i 于检测内毒素的方法主要有：家兔热原试验法、鲎实验 菌内毒素的一种生物传感器。结合适体与电化学分析 X a ［３］ 法、酶联免疫测定法和生物传感器等 。核酸适体由 两方面的优点，能将微小环境的变化转化为可测的电 n i ［４６］ 信号，对内毒素进行定性定量分析，弥补了当前内毒素 于其易于修饰、靶标分子分子范围广、特异性高 等 h 优点常常被选为生物元件。其中电化学分析技术作为 检测操作复杂，耗时长，灵敏度低等缺陷。 c 一种灵敏度高、操作简单、实时检测等优点的分析方 １　材料与方法 法，已经广泛的应用于生物传感器中，将其与核酸适体 相结合构建新一代核酸适体电化学传感器，已成为分 １．１　材　料 ［７］ 析与生命学科交叉研究的重要研究领域之一 。 １．１．１　试剂　氨基修饰的核酸适体序列：ＮＨ２（ＣＨ２） ［８］ ６５′ＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＴＧＧＴＡＴＧＣＴＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣ Ｖｏｓｓ 团队报道用细菌内毒素结合蛋白ＣＤ１４结构的 两条多肽类似物制备了细菌内毒素生物传感器。 ＧＧＣＧＣＣＧＴＴＡＣＧＣＧＧＴＣＣＴＴＧＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡ ［９］ ＧＴＡ３′（上海生工）；铁氰化钾、三水 ｏ亚铁氰化钾、１ Ｐｒｉａｎｏ 团队报道了利用细菌内毒素中和蛋白（ＥＮＰ） 作为识别分子，建立了用于检测细菌内毒素的电化学 乙基（３二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）、Ｎ ［１０］ 羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）、吗啉乙磺酸（ＭＥＳ），阿拉丁 方法。左明艳 通过两条适配体与内毒素形成三明治 结构的方式，构建了检测细菌内毒素的磁珠适配体传 试剂；３巯基丙酸（ＭＰＡ），国药集团化学试剂有限公 感器。国内外构建了不同类型的生物传感器，但是以