分子诊断在感染性疾病中应用.pptVIP

分子诊断在感染性疾病中的应用 袁艳军 感染性疾病的分子诊断策略 一般性策略（检出病原体的DNA/RNA）： 判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 分子探针杂交 完整性策略 检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序 感染性疾病的分子诊断临床价值 分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据 目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等 结核分枝杆菌(M.tuberculosis) 实验室诊断现状 现代分子生物学快速诊断 基因组特点 共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌 基因组全长4.4kb, 包含4000个蛋白质编码基因 和50个RNA编码基因 病毒性疾病的分子检测 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV） 全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区 每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因 中国：50%~70%的人受过感染，8%~10%是HBV携带者 急性感染时期HBV的标志物 HBV DNA FQ-PCR（real time PCR） 1．样本处理（样本处理区） 2．核酸扩增 2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区） HBV DNA FQ-PCR（real-time PCR） 结果判断： FQ-PCR进行HBV DNA的定量检测，检测范围为2.5×102~2.5×109 copies/ml 检测样本中5×102 copies/ml≤HBV DNA≤5×107 copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数 检测样本中HBV DNA5×107 copies/ml，既可直接报告为5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在1×105-5×107 copies/ml范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正 检测样本HBV DNA5×102 copies/ml时，拷贝数仅供参考，报告为小于最低检出限 Ct值无数值时, 报告为0.0 copies/ml 支链DNA（bDNA）技术 一种核酸探针杂交标志信号放大技术 。 优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单， 将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即 可进行检测 。 缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病 毒的检测 。 变异株与耐药突变检测 HBV可能发生自然变异 HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异 HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难 丙型肝炎病毒（HCV） 急性丙肝的临床诊断 1. 流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。 2. 临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和肝区疼痛等，其他可有低热，轻度肝肿大，脾肿大，黄疸。部分患者无明显症状。 3. 实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA阳性。 约90%的输血后非甲非乙型肝炎和70?80%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致 HCV 血中HCV含量仅为HBV的千分之一 HCV的细胞培养尚未成功，病毒的分离极为困难 HCV的变异性很高，使其诊断十分困难 HCV的免疫学标志仅有抗HCV一项，且由感染至抗体产生大约需要70天，部分病人感染后始终都不形成抗体 HCV基因组（单链RNA） 呈球形颗粒 直径约50nm 有一脂质包膜 核心：单股正链RNA，全长9.4 kb 仅一个开放读框（ORF），编码一条含有3008? 3037个氨基酸的病毒前体多肽 HCV基因分型的多样性 由于HCV的RNA聚合酶的忠实性不高，所以引起HCV的基因型呈多样性 HCV分为6个主要基因型（Simmonds）， HCV亚型已超过50个. HCV RNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案. HCV分子诊断 HCV-RNA定性试验 逆转录PCR 有许多因素影响着PCR方法，如标本处理及储存形式，引物设计、扩增倍数、反应条件、DNA产物的污染、扩增后产物检测系统等 严格的质控、操作人员的熟练程度尤为重要 HCV RNA定性检