液相色谱基础知识及应用.pptVIP

液相色谱仪器结构组成示意图 流动相储液瓶 单元或多元泵 梯度混合器 预柱 手动-进样器 自动-进样器 保护柱 色谱柱 柱后反应器 柱温箱 检测器 馏分收集器 积分仪 工作站 计算机 接口 温度控制单元 样品制备单元 3. 样品分析方法开发 样品预处理 样品预处理的目的是为了纯化样品。 完成纯化的方法有: 稀释- 用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品 过滤- 有不同孔径的过滤材料. 提示: 有的化合物可能吸附在过滤器上，从而影响定量. 离心- 可除去样品中的颗粒物质. 萃取-液液萃取，固相萃取 挥发- 采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂 样品准备 优化概览 优化应当是系统进行的，也就是说每个参数应当逐步变化. !!每次运行只改变一个参数!! 目标是在最短的分析时间内获得最好的分离结果. 优化溶剂强度 流速 温度 柱长 固定相* 优化 流动相的选择 流动相的选择原则是： ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境。 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 系统方法开发 ) 选择初始色谱柱 (直径, 长度, 填料粒度 ）- 4.6 x 250 mm, 5 ?m 使用适当的孔径 初始运行采用与流动相组成条件一致的pH ) 优化 k* (保留) 梯度范围, 时间, 斜率 流动相 - 很小变化 ) 优化回收率 样品的溶解性 温度的作用 键合相的作用 有机改性剂 ) 优化 ?* (选择性) 温度 键合相 pH (最后的手段) ) 优化 N (色谱柱条件) 流速 长度 填料粒度 分离度与 k’, N, 和 ? 的关系 初始 改变 k 提高 N 提高 a 梯度范围, 斜率 流速, 填料粒度, 柱长 温度、流动相、pH 优化 色谱的定性分析 色谱定性分析: 用保留值定性和色谱联用技术（如LC-MS、LC-FTIR)定性 利用保留值定性 基本依据：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留 值。但是，相反的结论却不成立，即在相同的色谱条件 下，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质 利用已知物直接对照进行定性分析 用绝对保留值定性－－一般要求用自动进样 用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性 利用文献值对照进行定性分析－－采用保留指数(I) 检测器信号响应与时间的关系 测量每个峰的保留时间 tR1 t0 tR2 time signal 色谱的定量分析 检测器信号响应与时间的关系 测量每个峰的峰面积 定量分析的基本公式： Mi– i组分的量；Ai–i组分的峰面积；fi– i组分的校正因子，与检测器的行为和被测组份的行为有关。 定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。 校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。 1. 面积百分法 (Area Percent) 2. 外标法 (External Standard) 3. 内标法 (Internal Standard) 4. 归一化法 (Normalized Percent) 色谱定量分析方法的种类 面积百分法 最简单的计算方法 样品中的所有成分对检测器的响应值相同 样品中的所有成分必须完全分离 表示样品中单一组份相对于其他组份的含量 面积 % = ( AI / ΣA ) * 100 AI = 单一色谱峰的面积 ΣA = 全部色谱峰的面积之和 不要求进样量准确 不适用于选择性检测器 归一化法(Normalized %) 将样品中所有组份的含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量的定量方法： 其中：xi－试样中组份I的百分含量 fi－组份I的校正因子 Ai－组份I的峰面积或峰高 归一化法