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Patch clamp膜片钳实验学习资料 ? Patch clamp膜片钳实验学习资料2011-06-03 10：26历史 1976~1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术(patch clamp technique)为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化.两位科学家1991年荣获诺贝尔生理或医学奖. 膜片钳技术是经微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，其值可小到pA(10-12A)量级，是一种典型的低噪声测量技术. 应当注意，为测量膜通道电流，必须将膜钳制于某一固定的电位上. 理论 生物电信号测量基础 电路中，基本组成元件为电阻器(R)、电感器(L)和电容器(C). 在生物系统中，电流的值很微弱(pA,10-12A~nA,10-9A).当细胞膜Na+通道开放时，一毫秒有104Na+跨膜，相当于1.6pA. 生物测量电路中存在两种导电机构(电子和离子)，需特制的电极和导电液体作为二者导电的接口. 生物体中的电阻器和电容器等元件，可用欧姆定律描述，但呈严重非线性特性时，用曲线描述. 几个基本定律： 欧姆定律：电流I流经一电阻R时，将在其两端产生电位差V=IR 基尔霍夫电流定律(KCL)：电路中，任何时刻，对任一节点，所以支路电流的代数和恒等于零. 基尔霍夫电压定律(KVL)：电路中，任何时刻，沿任一回路内所有支路或元件电压的代数和等于零. 电导器：电导是电导器对电流导电性能的电学量，用符号G表示，单位为西门子(S).而电阻是电路中电阻器对电流呈现阻力的电学量，用符号R表示，单位为欧姆(W).这两个电学量具有互补意义，互为倒数，即G=1/R.一个无穷大的电阻，其电导为零. 电容器：电容是储存电荷的电容器的电学量，用符号C表示，单位为法拉(F).电容器的电容量与极板面积成正比，与极板之间的距离成反比，还与绝缘层的介电性质有关. 当电容器两极板之间施加电压V时，则所存储的电荷Q=CV(单位：C-法拉，V-伏特，Q-库仑).细胞膜的电容常表示为每单位面积的电容量(比电容)，几乎所有的脂质双分子层约有1mF/cm2的电容量. 在电容器两端外接电压时，两极板之间将产生电场.细胞膜厚度约为10nm，若电压为100mv，则在膜产生很大的电场强度105V/cm.可被电压门控型离子通道的敏感机构所检测. 细胞膜电路参数特征表述：脂质双分子层的介电特性可用电容C表示，离子通道则用电导G表示. 可兴奋细胞膜的等效电路： 根据基尔霍夫电流定律(KCL)，可有 Im=ic+Ii=Cm(dVm/dt)+(Vm-Er)/Rm=Cm(dVm/dt)+Gm(Vm-Er) 其中，Vm-膜电位(V)；Im-总膜电流；ic-电容电流；Ii-离子通道电流(A/cm2)；Rm-膜的比电阻(W/cm2)；Gm-膜的比电导(S/cm2)；Cm-膜的比电容(F/cm2)；Er-静息电位，但某一离子形成Ii时，则Er被平衡电位Ei(对应于离子i)所替代. 可见，离子电流Ii取决于总的膜电导Gm与驱动力(势)(Vm-Er)的乘积.一般来说，细胞膜的离子电流是单个电流之和，即Ii=INa+Ik+ICl+×.每种离子产生的电流分量如INa=GNa(Vm-ENa). 微电极与导电溶液 微电极是生物测量中的传感器. 从导电角度来看，某些含水的离子溶液，如血液，胞浆及海水均遵守欧姆定律. 电流由两种离子运载，即阳离子和阴离子.当电流流过细胞膜离子通道时，选择性由一部分离子运载. 电极上的电子与溶液中的离子进行变换可能会出现误差.常用电极为银/氯化银电极. 细胞膜离子通道分类 电压门控通道： 膜受体门控通道： 胞内第二信使激活的通道： 通道电流的记录模式(recording configuration) 细胞贴附式：用于单通道记录 全细胞记录式：研究胞内第二信使时有着特殊的优势(但破膜后细胞变形，影响记录结果，可用穿孔膜片钳技术) 膜外朝外式：用于单通道记录 膜内朝外式：用于单通道记录 膜片钳实验系统的组成 机械部件：防震工作台，屏蔽罩，仪器设备架 光学部件：显微镜，视频监视器，单色光系统 电子部件：膜片钳放大器，刺激器，数据采集设备，计算机系统 微操纵器：机械式，机电式，液压式 玻璃微电极工艺 玻璃毛坯管：有软玻璃(苏打玻璃，电石玻璃)和硬玻璃(硼硅玻璃，铝硅玻璃，石英玻璃)之分. 软玻璃熔点低，易抛光，但1KHz的电导率是膜片记录的主要热噪声源(有较大的介电松弛特性) 硬玻璃拉制后有较窄的末梢(较高的电阻)；硼硅和硅硅玻璃有较好的噪声和介电松弛特性；石英玻璃特别适用于低噪声记录，但需激光源拉制. 玻璃微电极拉制工艺：垂直式拉制仪，水平拉制仪 电极熔锻仪和优化处理：一是为减小电极内部与溶液之间的电容(电