质粒提取、定量与酶切鉴定教材课程.pptVIP

质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定;pMD18-T;实验材料;;实验仪器;独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子 基因工程常采用的载体;碱裂解法； 煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法； 质粒DNA释放法； 酸酚法等;碱裂解法基本原理;pMD18-T;溶液S1（细菌悬浮液） 裂解液S2 中和液S3 去蛋白液W1 漂洗液W2 洗脱液 RNase A(100mg/ml) DNA吸附柱;实验流程;二、质粒DNA定量测定;操作步骤;DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸;DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0;数据处理;三、质粒DNA的酶切分析;限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为4～6个核苷酸的反向重复序列。;EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口??： ? EcoRⅠ：G↓AATTC ? HindⅢ：A↓AGCTT ;pMD18-T;反应物 ;影响酶切反应的因素;四、琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶;电泳：带电粒子在电场中泳动的现象;胶浓度（％）;琼脂糖凝胶的制备 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀 电泳 ：电压100v；30min 结果观察：凝胶成像仪　 ;琼脂糖凝胶电泳;向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀； 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6 μl ； 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80v；时间25～30分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 13. 取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。;琼脂糖凝胶电泳上样;DNA Marker (ladder) 　;Loading Buffer上样缓冲液;染色 溴化乙锭(Ethidium　Bromide，EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光, 优点：染色操作简便，快速；灵敏度高 缺点：有致癌性(使用时一定要戴手套);1 2