生物医学试验讲义.PDF

《生物医学实验》讲义 实验一 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验 一、实验目的 1．掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的制备方法。 2．熟悉微核的形态特征。 3．了解微核检测的实际意义和应用范围。 二、实验原理 染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分 裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细 胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。大小应为主核的1/20~1/5。微核的折光率及细胞化 学反应性质和主核一样。微核率与用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，所以可用简易的、 快速、灵敏的微核计数来代替繁杂的畸变染色体计数。微核检测技术目前已广泛应用在辐射 损伤以及化学诱变剂研究和新药、保健食品的毒理实验中。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞 的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体 已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，由于无核，极易观察到微核，因 此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验材 1．主要器材 显微镜，低速离心机，电子天平，解剖器械 （搪瓷解剖盘、探针、剪刀、 镊子），干净纱布，注射器、试管、试管架、磨口试剂瓶、滴管、染色缸、吸耳球、量筒、 清洁载玻片。 2．主要试剂 0.9％生理盐水、灭活的小牛血清、环磷酰胺、甲醇、磷酸盐缓冲液PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。 3．实验动物 成年昆明小鼠。 四、实验方法 1．环磷酰胺处理 取骨髓前24h先给小鼠腹腔注入环磷酰胺，注射剂量为 100mg／kg 动物体重。 2．取骨髓 用损伤脊髓法处死小鼠，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿 骨，用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头,然 后用注 射器吸取5ml 生理盐水，插入股骨一端，将骨髓细胞冲洗至10ml 的离心管中。可重复冲 洗多次，直至骨髓腔呈白色为止。 3．离心处理 将所获得的细胞悬浮液以 1000rpm离心10mi ，吸去上清液，在沉淀 物中加入2滴灭活的小牛血清，制成细胞悬液。 4．涂片 滴一滴悬液于载玻片一端，按常规方法涂片，在空气中晾干。 5．固定 将晾干的载玻片放入甲醇固定液中 10mi ，取出晾干。 6．染色 将制片平放在玻璃板上，用 Giemsa:PBS:瑞氏染液（1:9:10），染色15mi ， 流水冲洗后晾干即可镜检。 7．观察 先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色 良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞和微核计数。嗜多染红细胞为年幼红 细胞，呈灰蓝色，略大于红细胞（红色），微核多呈圆形和椭圆形，呈蓝紫色或紫红色。嗜 多染红细胞中微核多为一个，也可有两个或以上微核，此时仍按有微核的嗜多染红细胞计算。 8．结果分析 在显微镜下，每只小鼠骨髓涂片标本计数 1000~2000个嗜多染红细胞， 包括其中出现微核的细胞数，计算微核细胞率。计算公式如下： 含微核的细胞数 微核细胞率 100% 观察的细胞总数 五、结果意义 按 100mg/kg 体重剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺，其嗜多染红细胞微核率为千分之 48.9±3.6。正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常。 六、注意事项 1．防止小牛血清污染。 2．大腿骨须擦拭干净，以免影响结果。 3．涂片不要过厚或过薄。 4．选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区域镜检。由低倍镜到高倍镜，并 按一定顺序镜检。