常见的免疫组织化学技术.ppt

免疫组织化学技术 组织与细胞材料的制备 免疫组织化学方法 组织与细胞材料的制备 组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作 切片的制作 组织的固定 组织石蜡包埋 切片 组织材料的固定 目的: （1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。 （2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的 死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造 成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。 固定液的选择： (1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中 性缓冲福尔马林 (2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂 较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂 固定时间： 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 组织石蜡包埋 大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30 ～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。 小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。 切 片 载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。 切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。（2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml 切片： 石蜡切片： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年 冰冻切片： (1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理 24h，冰冻切片。 (2)冰冻切片后需凉干后立即固定 (3)冰冻切片固定后-80℃保存备用 细胞爬片制作 将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。 待细胞生长达到60％以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。 细胞涂片制作 离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。 吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。 待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。 在细胞上加一层甘油放-20℃保存。 免疫组化二步法 二步法免疫组化染色步骤 二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯 PBS冲洗3次，每次3分钟 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性 PBS冲洗、浸泡5分钟，3次 正常山羊血清室温