凯氏定氮法-精选（公开课件）.pptVIP

其中： 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等——多用于生产单位质量控制分析。 国外：红外分析仪 在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。 第三节 蛋白质的定量测定 （一）常量凯氏定氮法 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ①　用H3BO3吸收后再以标准HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ②　也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 1. 消化 2 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 2. 蒸馏与吸收消化液 + 40%氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。 “以奈氏试剂”检查。 3. 滴定 用HCl滴定 用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红） 终点：蓝色→微红色 说明及注意： ①本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗蛋白质）。结果准确，但费时。 ②所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ③同时作一空白试验，从消化开始到滴定。 ④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。  ⑤ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 ⑥ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑦ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。 ⑧ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑨蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸现象。 （二）微量凯氏定氮法 1、原理、步骤及适用范围同前 2、与常量法不同点：样品量、试剂用量 减少 加入硼酸量由50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见下图 。 （三）自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。 * 蛋白质的测定方法： 分两大类 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性基团、芳香基团等）测定蛋白质含量。 测定总氮量→ N%×F =粗蛋白质含量% 因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。 ！！！ 一、 凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。 改良：氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。 主要改良催化剂及消化蒸馏装置。 催化剂 煮沸 1、消化：NCOC + 浓H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、蒸馏与吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3↑+Na2SO4 + 2H2O ???? 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O 3、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds ) 凯氏定氮法原理（方程式） 整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定 1加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高 至400℃以上。也可