微生物生理学王海洪6细菌结构基因的鉴定副本.ppt

细菌基因文库构建 要求 制备100kb以上的基因组DNA。 选择合适的限制性内切酶，部分切割总DNA，回收25-40kb的DNA片段。 细菌基因文库一般选用cosmid克隆载体。 柯斯载体（cosmid）：一类人工构建的含有λ噬菌体DNA 的cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。 复制子一般为ColE1的，携带抗性基因，如AmpR。有λ噬菌体的cos序列。有多克隆位点（MCS），大小一般为7－10kb，能在大肠杆菌中转化和增殖。能携带大小为30－45kb的外源DNA片段。 体外连接时，外源DNA片段与柯斯载体连接成线性DNA，λ噬菌体头部包装蛋白识别线性DNA上的两个cos位点，进行包装，产生有感染能力的重组噬菌体颗粒，用于感染宿主细胞。 柯斯载体克隆的策略 体外包装 λ噬菌体在大肠杆菌体内以滚环形式复制，形成多联体线状DNA，其外壳蛋白能识别cos位点，并将两个cos位点间的DNA包装，形成成熟的λ噬菌体。 研究发现缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E 包装蛋白的λ噬菌体突变株，均不能单独包装λ 噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包装物(含E蛋白) 和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。 目前D包装蛋白和E 包装蛋白已经商品化，可直接用于包装重组DNA，感染宿主大肠杆菌，构建柯斯文库。 注意 完整的基因文库，必须使