任务5高效液相色谱法基本原理-精选（公开课件）.pptVIP

任务5 高效液相色谱法 分离原理 液相色谱分析法模块之 理解已知分析方法中采用的色谱类型 能够正确解释色谱分离过程 能够根据组分性质选择合适的色谱类型 能力目标 课程引入 归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85 外标法测定叶酸片中叶酸的含量 色谱柱: 4.6mm×250mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 磷酸二氢钠缓冲液:甲醇=80:20 液相色谱是如何完成混合物的分离？ 课程引入 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离 石油醚 碳酸钙颗粒 色素 玻璃柱 液液分配色谱法 实例：归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85 液液分配色谱 液液分配色谱法 固定相 将特定的液态物质涂于担体表面 化学键合于担体表面而形成的有机键合层 如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基键合硅胶 固定相类型 极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。 液液分配色谱 使用条件 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）。 太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 键合相色谱—固定相 特点 使用过程中不流失 均一性和化学稳定性好 重现性好分离效率高 适于梯度洗脱 传质阻抗小 反相色谱 常见流动相 流动相洗脱强度顺序：水甲醇乙腈乙醇四氢呋喃丙醇二氯甲烷（与水不混溶） 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 常见固定相 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。 键合相色谱—流动相 疏溶剂理论： 当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子； 当溶质分子被流动相推动和固定相接触时，溶质分子的非极性部分或非极性分子）会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合（吸附）形成缔合物，构成单分子吸附层； 当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并把溶质分子释放而被洗脱下来 反相色谱法的分离机理1 影响溶质保留的三个主要因素： 溶质分子中非极性部分的总表面积 溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱，疏水性越强，保留值越大。 键合相上的烷基总面积 烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。 流动相的表面张力 流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质的保留值大。 反相键合相色谱法的分离机理2 时间，min 固定相：C1 固定相：C8 固定相：C18 1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯 例：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。 分离机理实例 正相色谱法 反相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂??? 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物.? ??酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 1.非极性固定相 C18（简称ODS） 、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂??? 甲醇、乙腈、四氢呋喃 4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出 液液分配色谱 其他类型色谱法 按分离机制分类： 液固吸附色谱法 离子色谱法 凝胶色谱法（分子排阻色谱法） （空间排阻色谱法） 其他类型色谱法 氯化噻