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常见的实验三 对流免疫电泳
实验三 对流免疫电泳 【实验目的】 掌握对流免疫电泳的原理、操作方法、 结果判定及了解其用途。 【实验原理】 带电胶体颗粒可在电场中定向移动,移动速度及 方向与颗粒所带电荷及分子量大小有关。蛋白质 为两性电解质,每种蛋白质都有自己的等电点, 在pH值大于其等电点的溶液中,羧基解离多,蛋 白质带负电,向正极泳动;在pH值小于其等电点 的溶液中,氨基解离多,蛋白质带正电,向负极 泳动。pH值离等电点越远,所带电荷越多,泳动 速度也越快。因此,可通过控制溶液的pH值的方 法,使抗原抗体在通电的琼脂板上泳动,进行抗 原抗体成分的分析,或进行抗原抗体的检测。 电泳缓冲液pH为8.6,在这种溶液中: 抗原分子羧基解离带负电荷,且分子量小,泳动速度快,能克服琼脂中的电渗阻力,故在电泳时从负极向正极移动。 抗体属球蛋白,所暴露的极性基团较少,在碱性缓冲液电离也少,只带微弱的负电荷,且相对分子质量较大,电泳力较小,泳动速度慢,克服不了电渗阻力,在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动。 将抗体置正极端,抗原置负极端,则电泳时抗原抗体相向泳动,在两孔之间相遇,在比例最合适处就会形成白色沉淀线。 免疫电泳的特点: 免疫电泳是由琼脂扩散与电泳结合而成的一种检测技术。抗原抗体在凝胶中扩散的同时,加入电场力的作用,使抗体或抗原在凝胶中的扩散移动速度加快,缩短了试验时间;同时限制了扩散移动的方向,使集中朝电泳的方向扩散移动,增加了试验的敏感性,所以该方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏。 【实验材料】 1、电泳缓冲液0.05M∕LpH8.6巴比妥缓冲液。 2、抗体 羊抗人的IgG血清。 3、抗原 人的IgG。 4、1%琼脂 用pH8.6巴比妥缓冲液配置, 冰箱保存备用。 5、仪器 电泳仪、电泳槽 6、器械 载玻片、打孔器、10ml吸管、 移液器、移液头。 【实验方法】 1、1.0%琼脂板制备 ① 取pH8.6巴比妥缓冲液100ml置于搪瓷缸 中,加入1g琼脂粉,加热至完全溶解,冰箱保 存备用。 ② 加热熔化1.0%琼脂,待冷却至50~60℃时, 用10mL吸管吸取6mL加于载玻片上。 2、打孔 在凝固后的琼脂板上,用打孔器打两排 孔,孔间距为4mm。 3、加样 将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的 小孔中,抗体加入另一侧小孔中, 以加满为度,不可溢出孔外。 4、电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上, 抗原侧置负极端,抗体孔侧置正极 端。搭好桥后,接通电源,控制电 压6~10 V/cm板长,电泳约30~60 min。 5、关闭电源,取出琼脂板,观察结果。 【实验结果】 将玻片对着光源,观察抗原孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现,如有沉淀线,则表示阳性,否则为阴性。 【注意事项】 电泳时电流不宜过大,以免蛋白变性。 抗原和抗体的电极方向不能搞错。 抗原和抗体的浓度要适当,抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。 电泳所需时间与孔间距离有关,距离越大,电泳时间越长。 琼脂的质量要好(选用进口或者进口分装),否则不易出现结果,也可选用琼脂糖。 琼脂的浓度不宜太高(1%~2%),应以容易挑出孔内琼脂为宜。 【思考题】 1、对流免疫电泳有何特点? 2、对流免疫电泳中,抗原为何放阴极 端,抗体为何放阳极端? * * Ab Ag Ab Ag 标记孔 沉淀线
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