2018-2019高中生物第4章现代生物技术4.3聚合酶链式反应技术课件北师大版.pptxVIP

第3节　聚合酶链式反应技术;1.记住PCR技术的原理。 2.简述PCR技术的基本操作。 3.说出PCR技术的应用。;一;一;一;一;一;一;1.PCR技术与DNA的复制 PCR反应通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制,所以PCR反应与DNA复制的原理相同,计算方法也大体相同。例如:PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累,其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。;2.PCR的常见问题 PCR实验很容易出现假阳性(检测出非目的片段的扩增,而未检测出目的片段的扩增)或假阴性(未检测出任何片段的扩增)的结果。 PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增,因此模板DNA的污染是PCR出现假阳性结果的主要原因。此外,样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR操作时要注意做到隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。;出现假阴性结果的常见原因有Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制;引物设计不合理;提取的模板质量或数量不过关、PCR系统的建立欠妥当及循环次数不够,等等。当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶,并增加5~10次循环。为了防止假阴性结果的出现,在选用Taq DNA聚合酶时,要注意用活力高、质量好的酶。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高,但也不允许有机试剂的污染。所以,在提取DNA模板时,应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况,尤其需要保证引物的3端与靶基因互补。;PCR的原理及应用 【例题1】 下列有关PCR的描述,不正确的是(　　) A.是体外酶促合成特定DNA片段的一种技术 B.引物一般采用人工合成的单链DNA片段 C.PCR产物以指数方式增加 D.扩增对象是氨基酸序列 解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,以四种三磷酸脱氧核苷酸为原料,在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸,短时间迅速复制上百万倍的DNA片段,其扩增产物以指数方式增加。 答案:D;【例题2】 标准的PCR过程一般???为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是(　　) A.94 ℃、40 ℃、72 ℃ B.72 ℃、40 ℃、94 ℃ C.40 ℃、94 ℃、72 ℃ D.80 ℃、40 ℃、72 ℃ 解析:当温度上升到94~98 ℃时,双链DNA变性成单链,称之为变性;当温度迅速下降到40~60 ℃时,引物通过碱基互补配对与单链DNA结合;当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸。 答案:A;题型一;题型一;1;1;1;1;1;1