莲藕贮藏期主要致病真菌分离鉴定及其致病相关酶酶学特性的研究.docVIP

莲藕贮藏期主要致病真菌分离鉴定及其致病相关酶酶学特性的研究 　　摘 要：分别用组织分离法、直接挑取法和组织浸液划线法对贮藏期患病莲藕的病原菌进行分离，分离得到9种真菌，经回接发现9种真菌均致病。再通过形态学鉴定，初步确定9种真菌中有3种分别属于青霉属（Penicillium）、交链孢霉属（Alternaria）和芽枝孢霉属（Cladosporium），其他6种属于镰刀菌属（Fusarium），其中1株可产生红色素的镰刀菌的致病能力最强。选择产红色素的致病性最强的镰刀菌，通过测定活体外和活体内的聚甲基半乳糖醛酸酶（PGM）和羧甲基纤维素酶（Cx）2种细胞壁降解酶活性的变化研究该病原菌的致病机理，结果显示，在活体外，PMG的活性随着培养时间延长先增加后降低最后到基本不变，而Cx活性则持续缓慢增加，即在前期主要是PMG起作用，后期则主要是Cx起作用；在活体内，接菌的莲藕的PMG和Cx活性显著高于未接菌的藕（P＜0.05），说明PGM和Cx这2种细胞壁降解酶在病原菌的致病过程中起到了重要作用，是重要的致病因子。 　　关键词：莲藕；腐烂；病原菌；镰刀菌属；聚甲基半乳糖醛酸酶；羧甲基纤维素酶 　　 　　 莲藕是集果、蔬、药为一体的优质蔬菜，具有很高的营养价值、药用价值和经济价值。除鲜食外，还可作藕粉、莲藕汁饮料、速冻藕片、脱水藕片、清水藕、盐水藕、藕脯等加工制品[1]。近年来莲藕的种植面积逐步增大，并以水煮藕、盐渍藕、速冻藕和真空保鲜藕等形式出口到美国、日本和新加坡等国家[2]。但是莲藕采挖后，暴露于空气中易出现褐变、干缩、霉烂等现象，制约了莲藕贮藏、运输及出口销售产业的发展。目前针对莲藕已经开发出了系列抗褐变剂，结合涂膜、真空、低温等保鲜技术可以较好地控制褐变，然而在低温贮藏过程中霉变依然严重影响贮藏鲜藕的商品性。因此本研究对低温贮藏条件下霉变的莲藕，分离鉴定引起贮藏莲藕霉变的主要病原微生物，从酶学角度分析主要致病菌的致病机理，为低温贮藏条件下保持莲藕的新鲜度和品质提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　 供试材料取自2010年5～6月贮藏于4～10℃条件下，有典型的发霉或腐烂症状的莲藕；人工回接莲藕购于华中农业大学菜市场，品种皆为鄂莲5号（品种代号：3735）。CM304冻干血浆为北京陆桥技术有限责任公司生产。氧化酶试剂由法国biosMerieumx生产。 　　1.2 主要培养基 　　 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL[3]。 　　1.3 真菌的分离纯化 　　 为抑制细菌污染，先在200 mL PDA培养基中加入1 mL经过滤除菌的100 mg/mL的头孢霉素和2～3滴25%的乳酸，再倒平板。然后采用以下2种方法进行分离：①直接挑取霉菌菌丝接种到平板上，25℃倒置培养；②切取病健交界处组织，先用升汞消毒2～3 s，再用75%酒精消毒2 min，然后用无菌水冲洗，置于平板上，25℃倒置培养。待菌丝长出时，挑取菌丝移至另一平板培养，重复2～3次确保菌种纯化，然后于4℃斜面保藏备用。 　　1.4 致病性检测 　　 取PDA平板上培养5～6 d的新鲜菌体，用直径为6 mm的打孔器在菌落边缘打取菌碟进行回接。将藕表面清洗干净，用75%酒精擦拭消毒，并用无菌水冲洗3次，无菌操作台上晾干。将以上制备的菌碟和菌液分别采用“刺伤”和“无伤”2种方式进行接种，每6个藕为1组，并以无菌水涂抹处理为对照。接种后将藕置于铺有1层打湿的吸水纸的保鲜盒中，保鲜膜封口并用橡皮筋扎住周围，置于4～10℃冰箱。待莲藕发病后，对发病莲藕进行病原菌的再分离。 　　1.5 病原真菌的鉴定 　　 采用形态学方法鉴定。取灭菌的盖玻片斜插在PDA平板上，再接上纯化的菌种，25℃培养3～4 d。然后拔出盖玻片，置于载玻片上于显微镜下观察菌丝及孢子形态，记录观察结果并拍照，菌丝体或孢子无色的菌先用棉蓝进行染色，再拍照。根据菌落、孢子及孢子梗形态，参考《真菌鉴定手册》[4]、《真菌学》[5]、《普通真菌学》[6]等将其鉴定到属。 　　1.6 细胞壁降解酶的提取 　　 ①活体外病原菌细胞壁降解酶的培养及提取参考薛莲等[7]和冯晶等[8]的方法，向改良的Czaper液体培养基中加入果胶或羧甲基纤维素钠（CMC）作为碳源（果胶诱导产生果胶酶，CMC诱导产生纤维素酶），后分装于250 mL三角瓶中，每瓶装100 mL培养基。病菌在25℃培养5 d，用打孔器在菌落边缘打取菌碟，每瓶培养基中加入3片菌碟，25℃振荡培养，过滤除去菌丝，4℃下10 000 r/min离心25 min，取上清液作为待测酶液。 　　 ②采用乙醇―NaCl提取法提取病原菌感染后活体内细胞壁降解酶[