第六章 分子生物学研究方法（下）.pptVIP

6. 2. 2 高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 图6-12 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 6. 2. 3 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。 图6-14 植物基因敲除及突变体筛选 a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b，PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。 Identifiation of bard1-3 homozygous lines 6. 3 蛋白质及DNA相互作用技术 6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid sy