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提取库尔勒香梨叶片质外体汁液离心力的确认-农学论文 提取库尔勒香梨叶片质外体汁液离心力的确认 刘泽军，何天明，赵越，殷文娟 （新疆农业大学林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052） 摘要：本实验采用真空渗透离心法离取库尔勒香梨叶片质外体汁液，综合考量叶片汁液离出率、离心液样品与叶片质量比、离心液样品纯度，得到离取纯净香梨叶片质外体的离心力条件为4000~5000xg，温度4℃，离心时长为10min。本实验为库尔勒香梨叶片质外体汁液成分的研究提供了技术支撑。 关键词 ：库尔勒香梨叶片；质外体；离心力 收稿日期：2014-05-12 基金项目：国家自然科学基金项目；新疆维吾尔自治区果树学重点学科资助项目（201007）。 通讯作者：何天明（1970-），博士，教授，研究方向为果树栽培技术研发。E-mail：[emailprotected]。 高等植物的质外体由细胞膜外侧的构成细胞壁的纤维和微晶体空间及充满水和空气的细胞间隙所组成，分化完成的木质部也属于质外体。从分布上看，质外体分布于植物的各个组织中。近年来，越来越多的研究表明：植物体对空气污染物的解毒、水分的吸收、害虫的防御、离子物质的吸收转运、营养物质的贮存、缺乏和过量中毒的反应、信号的传导（如植物激素）等都需要质外体的参与，因此，质外体对高等植物有非常重要的意义。目前，对植物营养研究而言，根系质外体的研究已有较多相对成熟的方法，但叶片质外体却是难点，原因在于缺乏有效的令人信服的方法提取叶片质外体液体，从而去了解质外体的组成。 科研工作者常采用微电极、射线能谱分析仪、离子敏感荧光染色计来测定质外体溶液中的离子浓度；采用压力室法、灌注法、洗脱法、渗透离心法来获取叶片中质外体汁液。Dannel等将灌注法和离心法相结合来提取叶片质外体汁液，效果较好。林杉等在把磷酸己糖异构酶（HPI）作为标志性酶的基础上，采用渗透离心法获得了蚕豆叶片质外体汁液。但是，不同植物因离心条件差异较大，离取质外体汁液时离心力也是不同的。本实验为有效离取香梨叶片质外体汁液，采用渗透离心法，综合考量离心液样品纯度、离取率和离心液样品质量与叶片质量比，以此来确定合适的离心力。 1材料与方法 1.1材料及来源 1.1.1植物材料 试验材料来源于新疆巴州沙依东园艺场二分场，树体为20年生香梨树。采集正常香梨树不同方位当年生枝条中部正常绿叶300片。叶片自叶柄处剪下，迅速装入有小孔的自封袋，放进盛有冰袋的保温箱中带回实验室，泡沫箱中的温度一定要小于4℃。 1.1.2主要药品 0.2 mol/LNa2HP04溶液、0.2mol/LNaH2P04溶液和渗透用0.28 mmol/L山梨醇溶液。 酶活力测定用缓冲溶液A （pH=8）：100mmol/L三羟甲基甘氨酸（HEPES）、30mmol/L山梨醇、2mmol/L二硫苏糖醇（DTT）、1mmol/L氯化钙（CaCl2）、1%聚乙烯吡咯烷酮（Polar AT）和1%牛血清蛋白。 酶活力测定用反应介质溶液B（pH=8）：50mmol/LTris、5mmol/L氯化镁（MgCl2）、1mmol/L氯化钠（NaCl）、0.39mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）、0.46U/mL6 -磷酸葡萄糖脱氢酶（G6P -DH）和1.4mmol/L果糖-6-磷酸（F-6-P）。 以上所有试剂均需现用现配。 1.2试验方法 1.2.1香梨叶片质外体汁液的提取 将采回的新鲜香梨叶片用去预冷的离子水洗净、擦干。准确称取完整叶片质量，放入负1个大气压的真空中渗入预冷的0.28mmol/L山梨醇溶液，直到叶片颜色变深，表面有大量小气泡时为止，时间约为8min。叶片从山梨醇溶液取出后去离子水洗净、擦干、称重。将叶片用洗净的塑料膜轻轻卷起，叶柄朝一个方向放入5mL注射器管（注射器管注射端固定有200μL离心管）。将此带有叶片的装置盛入50mL大离心管中，放入Beckman离心机中离心。采用的离心力有1000xg、2000xg、3000xg、4000xg、5000xg、6000xg、7000xg、8000xg、9000xg和10000xg,温度4℃，时间10 min，试验重复6次。 1.2.2香梨叶片匀浆的制备 将采下的新鲜叶片擦净，称取0.5g左右，用液氮快速冷冻，带回实验室后倒入研钵中快速研磨匀浆，用3 mL上述缓冲液A提取HPI，实验操作中温度≤4℃，以防要测定的酶失活，实验重复3次。