《荧光PCR技术》精选课件.pptVIP

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 标准曲线→定量 定量PCR（quantitative PCR） 用PCR方法定量主要有两种： 终点定量（end point PCR）在PCR循环结束后对PCR扩增产物进行测定量化，而PCR到达平台期时检测重现性差，无法准确定量。 对数期定量（Log phase PCR）在PCR的对数增长期对PCR扩增产物进行测定量化，最大定量范围可达到10个数量级，如荧光定量PCR。 Standard Curve(标准曲线)：CT/TC/CP与起始模板量的对数呈反比关系： Y=-aX+b 其中X=Log Concentration Y=CT/TC/CP PCR扩增过程中，引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的CT/TC/CP值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算出未知样品的起始模板浓度。 * 荧光PCR？ 扩增产物荧光指示 动态监测荧光信号变化 荧 光 物 质 光能 热能 转移给临近的分子 荧光标记信号的产生 荧光标记基团在某波长的激发光刺激下， 产生一个更长波长的发射光 FRET？当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。 Taqman？ 特异性荧光双标记探针 Taq酶 5’→3’外切酶活性 Molecular beacon？ 荧光标记杂交双探针 变性 退火 延伸 CT值—样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数 （cycle threshold value) 定量PCR的数学原理 斜率与扩增效率 对数期分析与终点分析的比较 荧光PCR重现性 荧光双检多检检测试剂 原理 针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶DNA，并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。 特点 一次性处理样品 一次性反应 一次性给出2种或2种以上病原体检测结果 两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰 竞争性荧光内标(IC) 定量PCR技术 竞争性荧光内标(IC) 什么是IC? Internal control简称IC，通常是指与靶序列十分相似的一段DNA序列，两者在相同的条件下可被同一对引物扩增；区别在于两者的探针结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。 IC的作用 监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。 内标工作原理图 荧光PCR特点 灵敏度高 特异性强 全封闭PCR过程，无需后处理 采用dUTP—UNG酶的防污染系统，有效降低污染机会 即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量 定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品 可实现一管多检 仪器自动分析，更快获得结果 Taqman原理： 除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端标记一个荧光基团，3’标记另一个荧光基团。此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光基团（发生FRET），因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而受光刺激激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 * * * Taqman原理： 除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端标记一个荧光基团，3’标记另一个荧光基团。此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光基团（发生FRET），因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光基团发出的荧光信号。但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换；激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而受光刺激激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数