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阪崎肠杆菌分子检测的研究进展 　　摘要：对分子生物学法检测阪崎肠杆菌的研究进展及在分子检测中内部扩增参比（内参）的应用作一综述。 　　关键词：阪崎肠杆菌；分子检测；婴儿配方奶粉 　　中图分类号：Q 939.121文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)07-0044-05 　　Development of Molecular Detection of Enterobacter sakazakii 　　ZHANG Chao， ZHANG wei*，LIU Wei-hua ， MA Xiao-yan， SU Xu-dong，LI Ying-jun 　　（College of Food Science and Technology, Hebei Agriculture University, Baoding 071001, China） 　　Abstract：This study reports the development of molecular detection of Enterobacter sakazakii and the application of internal amplification control in molecular detection assays. 　　Key words：Enterobacter sakazakii；molecular detection；infant formula milk powder 　　 　　阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）作为肠杆菌科的一种，曾一直被称为黄色阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），直到1980年才以日本细菌学家Riichi Sakazakii的名字命名为“阪崎肠杆菌”，以表彰他在肠道细菌学研究方面的突出贡献[1]。1961年英国两位科学家首次报道2例由此菌引起的脑膜炎病例，以后在世界范围内相继报道了由此菌引起新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。1979年Monore 等[2]首次报道了阪崎肠杆菌感染但无脑膜炎症状的新生儿菌血症。美国 2002 年的监测表明，1 岁以下婴儿阪崎肠杆菌的感染率为1/10 万，出生体重偏低的新生儿感染率则是 8.7/10 万，死亡率高达 20%～50% [3]。 　　尽管可从多种食品中检出阪崎肠杆菌，但在新生儿感染事件的调查中，发现婴儿配方奶粉是主要的感染渠道。婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污染引起了FAO/WHO及各国的高度重视。国内传统检验是参照FDA推荐的方法，其检出时间长达6~7 d，实验步骤繁琐，可操作性差。近年，随着分子生物学的发展，越来越多的分子检测技术用于阪崎肠杆菌的检测，如分子克隆、测序、核苷酸序列分析、实时PCR等。内参的加入对整个实验过程进行了监测，排除了实验的假阴性，目前国外已用于医学检测领域，“假阴性”的排除对于检测病原微生物尤其是食源性致病菌更为重要。我们在简要介绍阪崎肠杆菌生物学性状和传统检测方法的同时，重点介绍阪崎肠杆菌在分子检测领域的进展及内参的作用、类型和构成等。 　　 　　1 阪崎肠杆菌的生物学性状及传统检测方法 　　 　　1.1阪崎肠杆菌的生物学性状 　　与其它肠杆菌不同的是，阪崎肠杆菌D-山梨糖醇发酵阴性，产胞外DNA酶，在TSA、BHI琼脂和血平板上培养48~72 h长出黄色菌落，在25 ℃培养比在36 ℃培养黄色色素产生更显著，而且株与株之间黄色色素产生水平也有差异。阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶活性为阳性，其它肠杆菌则为阴性，而且只有阪崎肠杆菌缺少内酰胺酶[1]。对其抵抗力的研究表明，阪崎肠杆菌不具有特殊的耐热性，标准的巴氏杀菌即可将其杀死，但它能耐受一定程度的干燥和渗透压，而且比大肠埃希氏菌和沙门菌要强[1，4]。国际上对其毒力的研究报道很少，有学者描述某些阪崎肠杆菌可能产生一种毒力因子-类肠毒素样化合物，而且阪崎肠杆菌之间的毒性明显不同[4]。阪崎肠杆菌的其他生化特性见表1[5] 　　 　　1.2阪崎肠杆菌的传统检测方法 　　目前国内较常用的检测方法主要有两种，一种来自FDA的检测程序，对婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌分离与计数[6]，用“三管法”增菌可检测样品中微量的阪崎肠杆菌并定量，检测时至少需要333 g样品。无菌称取100，10，1 g婴儿配方奶粉用蒸馏水溶解，36 ℃培养过夜，每种处理均用3个重复（即3管法），各取10 mL培养液加入90 mL肠道菌增菌肉汤36 ℃培养过夜，然后取培养物适量进行VRBG琼脂平板划线，36 ℃培养过夜，挑取疑似菌落进行TSA平板划线，25 ℃培养48~72 h，从TSA上挑取黄色菌落用API20E生化鉴定系统鉴定，同时进行氧化酶实验，查MPN