牛SPAG11D基因地原核表达及其抑菌活性研究.docVIP

牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究-农学论文 牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究 胡修忠，凌明湖，王定发，程 蕾，向 敏，刘晓华，夏 瑜 （武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉 ４３０２０８） 摘要：为了检测重组蛋白ＳＰＡＧ１１Ｄ的抑菌活性，提取牛睾丸组织总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增了ＳＰＡＧ１１Ｄ基因，将该基因插入ｐＥＴ－３２ａ（＋）融合表达载体，并转入ＢＬ２１（Ｄ３）进行原核表达，通过改变ＩＰＴＧ浓度和诱导时间优化表达条件，并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示，成功扩增牛ＳＰＡＧ１１Ｄ基因，产物大小为３９０ ｂｐ，其序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布序列相一致；正确构建了原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＳＰＡＧ１１Ｄ，重组蛋白最佳表达条件为ＩＰＴＧ终浓度１．０ ｍｍｏｌ ／Ｌ、诱导时间为４ ｈ；表达产物的分子质量约为３３ ｋＤａ；该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛ＳＰＡＧ１１Ｄ基因的原核表达载体，并获得了具有抑菌活性的重组蛋白Ｈｉｓ－ＳＰＡＧ１１Ｄ。 关键词 ：牛；原核表达；ＳＰＡＧ１１Ｄ基因；抑菌作用 中图分类号：Ｓ８２３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1135-04 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.027 收稿日期：２０１４－１２－１６ 基金项目：武汉市农业科学技术研究院创新基金项目（ＣＸ２０１２４５） 作者简介：胡修忠（１９８０－），男，山东曹县人，畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖工作，（电话）０２７电子信箱）ｈｕ＿ｘｉｕ＿ｚｈｏｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。 精子相关抗原１１（Ｓｐｅｒｍ aｓｓｏｃｉａｔｅｄ aｎｔｉｇｅｎ １１，ＳＰＡＧ１１）是精子膜上的一种蛋白，也是β防御素的一种，由２个相互独立的β防御素基因通过通读转录连接到一起［１］，主要在哺乳动物的睾丸、附睾和雄性生殖道中表达。ＳＰＡＧ１１被认为在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明带的识别和精卵结合等事件中起到重要的作用［２－４］。 雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能，如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动［５］。而ＳＰＡＧ １１蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的ＳＰＡＧ１１各蛋白亚型研究表明，其Ｎ－端都具有抗菌活性，而且人的ＳＰＡＧ１１Ｃ蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型Ｎ－端的抗菌活性［６，７］。此外还发现，猕猴的ＳＰＡＧ１１蛋白也具有抗菌活性。 目前认为ＳＰＡＧ １１在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。Ｚｈｏｕ等［４］发现大鼠附睾头部的ＳＰＡＧ１１Ｅ蛋白结合在精子的头部，在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部，这表明ＳＰＡＧ１１Ｅ蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用，此外ＳＰＡＧ１１Ｅ蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。 在牛体内共发现６种ＳＰＡＧ１１蛋白亚型：ＳＰＡＧ１１Ｃ、ＳＰＡＧ１１Ｄ、ＳＰＡＧ１１Ｅ、ＳＰＡＧ１１Ｕ、ＳＰＡＧ１１Ｖ、ＳＰＡＧ１１Ｗ［８］，它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等［９］在牦牛生殖器官中也检测到了这６个亚型的表达。 １ 材料与方法 １．１ 试剂 Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ｃＤＮＡ反转录试剂盒、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和 ＢａｍＨ Ｉ限制性内切酶均购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购于Ｂｉｏｌａｂｓ公司；ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ质粒快速提取试剂盒、ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ琼脂糖凝胶ＤＮＡ纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；ＴＥＭＥＤ购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司；异丙基－Ｂ－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）购自Ｍｅｒｃｋ公司；氨苄青霉素（Ａｍｐ）购自Ｓｉｇｍａ公司；丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）等均为国产分析纯试剂。 １．２ 菌种和质粒 Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）购自北京全式金生物技术有限公司；ｐＥＴ－３２ａ（＋）、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌Ｏ１３９、大肠杆菌Ｏ１５７、大肠杆菌Ｋ８８、大肠杆菌Ｋ１９９和沙门氏菌为本实验室保存。 １．３ 试验动物 刚出生的小公牛。 １．４ 引物设计 根据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的牛抗精子抗体ＳＰＡＧ１１Ｄ（ＫＣ８９９３１８．１）基因的核苷酸序列设计特异引物：Ｐ１： ５′－ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＴＣＧＣ －３′，Ｐ２：５′－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧ－３′ １．５