猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒地研制.docVIP

猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制-农学论文 猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制 余 波，周思旋，谭诗文，徐景峨，史开志，杨 莉 （贵州省畜牧兽医研究所，贵阳 ５５０００５） 摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪细小病毒ＶＰ２基因序列设计特异性的引物，ＰＣＲ扩增获得猪细小病毒ＶＰ２基因片段，并克隆到ｐＭＤ－１８Ｔ载体上作为阳性标准品。通过对ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化，建立了猪细小病毒的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ诊断方法，以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现１个单特异峰，无引物二聚体，对ＰＲＶ、ＰＣＶ－２、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ均无阳性信号扩增，可重复性好，测灵敏度可达１．０×１０１拷贝／μＬ。结果表明，研制的猪细小病毒ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点，适合于猪细小病毒临床样品的检测。 关键词 ：猪细小病毒；ＶＰ２基因；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量 中图分类号：Ｓ８５２．６５＋９．１文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０１－０126－０4 ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０33 Developing Ａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉng ｏｆ ＰＰＶ ＹＵ Ｂｏ，ＺＨＯＵ Ｓｉ－ｘｕａｎ，ＴＡＮ Ｓｈｉ－wｅｎ，ＸＵ Ｊｉｎｇ－ｅ，ＳＨＩ Ｋａｉ－ｚｈｉ，ＹＡＮＧ Ｌｉ （Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００５， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Based on ｔｈｅ ＶＰ２ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＰＶ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ， ｏｎｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ＶＰ２ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＶＰ２ ｇｅｎｅ ｏｆ ＰＰＶ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ－１８Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚing ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ， ａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓly ｄｅｔｅｃｔｉng ＰＰＶ． Ｔｈｅ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅ ｓｈｏｗｅｄ ｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅａｋ. Nｏ ｐｒｉｍｅｒ－ｄｉｍｅｒｓ ｐｅａｋ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Nｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ＰＲＶ， ＰＣＶ－２， Ｅ．ｃｏｌｉ， ＣＳＦＶ， ＰＲＲＳＶ with ｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ＰＣＲ ｋｉｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ to １．０×１０１ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ＤＮＡ． It is ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｋｉｔ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ. Iｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＰＰＶ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＰＰＶ； ＶＰ２ ｇｅｎｅ； ＳＹＢＲ gｒｅｅｎ Ｉ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ qｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ 收稿日期：２０１４－０９－２９ 基金项目：贵州省农业攻关项目［黔科合ＮＹ字（２０１０）３０８５］；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目［黔科合院所创能（２０１０）４００４］ 作者简介：余 波（１９８１－），男，四川邻水人，副研究员，硕士，主要从事兽医分子生物学研究，（电话）１５０８５９１６６６１（电子信箱）ｙｕｂｏｎｋｙ＠１６３．ｃｏｍ； 通信作者，谭诗文（１９５６－），男，研究员，主要从事兽医分子生物学研究，（电子信箱）ｓｗｌｅｉｄｅｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。