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* * * * * * * * * * * * * * * 蛋白质相互作用 2012-5-22 FRET ELISA 蛋白质芯片 SPR ITC FRET现象 当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子接近到一定距离（1-10nm）时，就会发生一种非放射性的能量转移，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。 FRET技术原理 以适当频率的光能照射供体, 会有效地产生振荡偶极子, 与近处的受体探 针的偶极子产生共振。这种偶极子与偶极子之间的相互作用将供体荧光团的能量非放射性地转移到受体荧光团。对于特定的供体-受体对, 供体丢失的能量就是受体得到的能量。Forster 显示这个过程的效率依赖于供体和受体间距离六次幂的倒数:E =1/{1 +(R/R0)6}(R0是一半能量发生转移的距离)，还依赖于染料的光谱特性及它们的相对方向。 FRET应用 FRET技术已广泛用于研究胞内及跨膜蛋白的磷酸化过程、蛋白质在胞内的折叠、蛋白质之间的相互作用等。将两种蛋白质分别使用CFP／YFP(或BFP／GFP)标记，当两者在同一细胞中表达时，只要检测到FRET发生，则证明两蛋白质问距离小于10nrn，存在相互作用。 ELISA原理 ELISA的类型 1、双抗体夹心法 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗。 检测液相中的可溶性抗原。 ELISA的类型 2、间接法 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗。 检测液相中未知抗体。 ELISA的类型 3、直接法 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗体或抗原。 ELISA的类型 4、竞争法 对照孔：酶标抗体 测定孔：酶标抗体和待测抗体 抗原中杂质难以去除或抗原结合，特异性不稳定 eg:HBV的e抗原很容易转化为核 心抗原（29氨基酸差异） 显色强弱与待测抗体的含量成反比 5、生物素和亲和素标记法 ELISA的类型 检测抗体生物素化SA标记酶 ELISA的应用 ELISA的优点及存在的问题 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性； 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测； 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值； 使用方便，有各种各样的商业化试剂盒。 样品的干扰物质多 固相载体的质量不统一：原料及制备工艺不一致，不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能差，影响实验结果 对ELISA法的非特异性难以评价 试剂无统一标准 优点 存在的问题 蛋白质芯片 蛋白质芯片可以用来大规 模筛选蛋白之间的相互作 用。将荧光标记的探针蛋 白与蛋白质芯片孵育，洗 脱非特异性结合的蛋白 后，可以通过扫描芯片上 的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。 1、检测型蛋白质芯片 将不同类型的配体，包括抗体、抗原、核酸、肽、有机小分子、糖类分子或者一些具有高度亲和力的特异性识别分子固定在修饰化的固相基质表面上，靶标蛋白存在于溶液中，用于芯片分析。这类芯片主要用于监测靶标蛋白的含量、表达水平、蛋白质在细胞和组织中的分布及对诊断标志物的分析，即蛋白质表达谱(定量)的分析。 2、功能型蛋白芯片 它的识别分子主要是通过高通量的蛋白纯化、人工合成多肽或化学分子制备而成，然后将其点在合适的固相基质表面。这类芯片主要适用于蛋白质的生化功能以及相互作用研究，如蛋白质的结合特性、酶的催化活性、蛋白质转录后修饰的研究、小分子药物和药物靶标的筛选和鉴定等，即蛋白质与蛋白质及其他分子相互作用谱图的研究网 蛋白质芯片的分类 蛋白质芯片制作的基本流程 (1)蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化可能引起最后结果的不同，条件不易控制，实验结果可重复性相对不足。 (2)目前用于蛋白质芯片制备的固相介质(如化学膜、凝胶和玻片)都存在一些缺点，蛋白质在固相基质表面的固定往往会造成其解折叠，从而失去生物活性。 (3)对结果的扫描、背景去除、数据处理等还不圆满，会导致假阳性、假阴性的存在。 蛋白质芯片技术存在的问题 SPR (等离子表面共振技术) SPR原理 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当 蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用， 那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改 变。 SPR技术特点 1、无需标记，避免了费时而昂贵的纯化和标记 2、 实时检测 3、样品用量少(1ug) 4、检测灵敏度高（C0.01ng/ml） 5、无损伤检测 6、快捷方便 需预先制备传感器芯片 ITC ITC（等温滴定微量热技术）是一种监测由结合成分的添加 而引起的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物 分子间相互作用的重要方法。