高效发酵木糖重组酵母菌株YPH499CZ发酵条件的研究.docVIP

高效发酵木糖重组酵母菌株YPH499CZ发酵条件的研究 　　[摘要] 目的 对能够高效利用木糖发酵生产乙醇的重组酵母菌株YPH499-CZ发酵培养条件进行优化。方法 通过单因素实验优化发酵条件,考察多种营养元素以及培养温度、发酵培养基起始pH值因素对重组酵母菌株发酵木糖产生乙醇的影响。结果 在木糖发酵培养基中添加氯化钙和硫酸铵能不同程度提高发酵产乙醇的效率,添加磷酸二氢钠效果不显著,添加肌醇和植酸钠在一定浓度范围内可提高重组菌株发酵效率,最佳发酵温度30℃,最佳起始pH为5.5。结论 添加一定营养盐可提高重组酵母菌株发酵效率。 　　[关键词] 木糖发酵; 重组酵母菌株; 培养条件; 生长曲线 　　[中图分类号] TQ92 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)15-11-03 　　 　　随着工业迅速发展、人口增长和人民生活水平的提高,能源短缺已经成为世界性问题,能源安全受到各个国家的重视[1]。乙醇是一种重要的化工原料,可以添加到汽油中使用,也可以完全替代汽油充当燃料,并且是一种完全清洁的能源,符合当前环保理念,我国早在“十五”规划中就制定了发展燃料乙醇的规划[2]。目前乙醇主要由淀粉原料发酵制得,以粮食换取乙醇的方法无疑是一种巨大浪费,有些国家已经明令禁止利用粮食生产乙醇,因此利用廉价易得的纤维素类物质例如秸秆生产乙醇成为合理选择。利用酵母菌发酵生产乙醇已有多年历史,然而普通酿酒酵母菌株不能利用木糖发酵,而木糖是木质纤维素水解后的主要成份,我们用基因工程手段对酿酒酵母菌株进行改造得到重组酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-CZ,其能够利用木糖发酵生产乙醇,具有潜在的应用前景。 　　目前已知的酵母菌有490余种,酵母具有个体大、蛋白质含量高、杂食性强、易分离、易培养、代谢产物多、综合利用广等特点,在现代工业中得到了广泛应用。为了使重组酵母菌株YPH499-CZ得到进一步应用,须了解该酵母菌株生长特点,掌握其最佳生长条件。本文系统研究了多种营养元素对该菌株发酵产生乙醇的影响,并且对其发酵最适温度和最适起始pH值进行了研究。 　　1 资料与方法 　　1.1 菌株 　　重组酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YPH499-CZ由河北省药物质量研究室构建并保存。 　　1.2 培养基 　　种子培养基(YEPD培养基)(M/V):葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母粉1%;斜面培养基:YEPD培养基每升加琼脂粉20g;木糖发酵培养基(M/V):木糖5%,蛋白胨3%,酵母粉3%。 　　1.3 发酵培养 　　从斜面保存菌种接种于YEPD培养基,250mL摇瓶装液量100mL,30℃ 180rpm培养24h作为种子;1%接种于木糖发酵培养基,250mL摇瓶装液量100mL,接种后30℃ 180rpm培养72h;测定木糖消耗与乙醇产量。 　　1.4 乙醇含量分析测定方法 　　乙醇浓度利用SBA生物传感分析仪测定(山东省科学院生物研究所)。 　　1.5 发酵培养条件的优化 　　分别考察额外添加无机盐:氯化钙、硫酸铵、磷酸二氢钠以及外加肌醇和植酸钠对重组酵母菌株发酵生产乙醇性能的影响,并对发酵培养基最适起始pH值及培养温度的选择进行优化。 　　1.6 生长曲线测定 　　在一定的范围内,微生物细胞浓度与光密度(OD值)成正比,因此通过测定发酵液OD值可以确定酵母菌的浓度。本实验使用722可见光分光光度仪,600nm波长测定其吸光度。取150μL发酵液稀释20倍至3mL,以液体培养基为空白对照进行比色测定,OD600=读数×稀释倍数。 　　2 实验结果 　　2.1 氯化钙、硫酸铵、磷酸二氢钠对酵母菌株发酵的影响 　　在木糖发酵培养基中分别添加氯化钙、硫酸铵、磷酸二氢钠,使各营养盐终浓度达到0.025%、0.05%、0.1%、0.2%。接种后于30℃ 180rpm培养72h,测定发酵液中乙醇含量,分别计算其乙醇转化率(YE/S),结果见表1。 　　由表中可见,在发酵培养基中额外添加适量营养盐类可不同程度提高酵母菌株YPH499-CZ发酵木糖生产乙醇的效率。其中添加氯化钙最适浓度为0.1%,添加硫酸铵最适浓度为0.1%,添加磷酸二氢钠最适浓度为0.025%。 　　2.2 肌醇对重组酵母菌株发酵的影响 　　在发酵培养基中额外添加肌醇使终浓度分别达到0.01%、0.05%、0.1%和0.2%(M/V),在30℃ 180rpm培养72h,测定发酵液中乙醇含量,计算发酵木糖的乙醇转化率(YE/S),计算方法同前。肌醇对重组酵母菌株发酵木糖产生乙醇有明显促进作用,在发酵培养基中添加肌醇0.1%时乙醇产量达到最高。见图1。 　　2.3 植