《12、血清谷丙转氨酶活性的测定》-精选·课件.pptVIP

血清谷丙转氨酶活性的测定（King法） 【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 【原理】 生物机体内转氨基作用是α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α－酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase , GPT），谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase , GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸： 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。 King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在 37℃与 pH7.4 的基质液作用 60min，生成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。 试剂与器材 1、样品 动物或人血清 2试剂 1) 甲液（1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4，A. R.）9.47g 或含十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，A. R.）23.87g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 2) 乙液（1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液） 称取磷酸二氢钾（KH2PO4，A. R.）9.078g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 取甲液 825mL，乙液 175mL 混合，此液 PH应为 7.4。 3) GPT 基质液 称取α－酮戊二酸 29.2mg（2mmol/L）及α－DL－丙氨酸 1.78g（200 mmol/L）溶于 50mL pH7.4 的磷酸缓冲液中，加 0.1 mol/L NaOH溶液约 0.5mL，调节 pH为 7.4，然后加磷酸缓冲液定容至 100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存。 4) 2，4－二硝基苯肼（1mmol/L） 称 2，4－二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。 5) 丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后定容至 100mL。此溶液浓度为 2μmol/mL，临用前配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）。 3、器材 试管及试管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL），量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光光度计，坐标纸。 实验内容和步骤 1) 制备标准曲线 2) 绘制标准曲线 以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对应的酶活性单位数的标准曲线。 结果计算 标准曲线测定法 根据样品管 A520 值（已减去空白管 A520）查标准曲线，即得每 100mL 血清中转氨酶活性单位数。 标准管测定法 每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液（2μmol/mL）0.1mL，平行操作，即按上表操作，不做标准曲线，测定A520按下公式计算： 比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义