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-半乳糖苷酶的克隆及表达 学生：王琳 殷娴 李海音 高烨 彭林 一、细菌基因组DNA 的制备 （微量） 1 材料与试剂 TE 缓冲液（10mmol/L Tris-HCL, pH8.0; 1mmol/L EDTA, pH8.0 ） 10%(w/v)SDS 20mg/ml 蛋白酶K 5mol/L NaCL CTAB/NaCL 溶液（4.1g NaCL 溶于80ml H2O ，缓慢加入10gCTAB-十六烷基三甲基溴化铵， 同时搅拌，加水至100ml ） 24:1 氯仿/异戊醇 25 ：24 ：1 苯酚/氯仿/异戊醇 异丙醇 70%乙醇 2 方法： （1） 从蟑螂埃希氏菌（Escherichia blattae ）平板上挑一单菌落，接种于5ml LB 液体培养基中， 37℃振荡培养12hour 左右。取1.5mL 转入小离心管中，冰上放置10min 。4 ℃，4000r/min, 离心2min 。 （2 ） 倒净上清培养液，加入567ul TE 缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30ul 10%SDS 和3ul 20mg/ml 蛋白酶K，混合，37℃温浴 1hour 。 （3 ） 加100ul 5mol/L NaCL，混匀，再加入80ul CTAB/NaCL 溶液混匀，65℃温育 10min 。 （4 ） 加等体积氯仿/异戊醇，慢慢旋转混匀。4℃，10000r/min，离心 4-5min 。用扩口枪头转 上清至一新离心管中。（如果难以移出上清，可以先用牙签去除界面物质） （5 ） 重复步骤 （3）（4 ），直到看不见界面为止。 （6 ） 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，4 ℃，10000r/min，离心5min 。用扩口枪头转上清至一新 离心管中。 （7 ） 加0.6 倍体积异戊醇，轻轻混匀至DNA 沉淀。4 ℃，12000r/min，离心5min，弃上清， 用1ml 70% 乙醇洗涤沉淀，4 ℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温下干燥。用100ul TE 缓冲液悬浮DNA ，-20 ℃保存。 二、PCR 扩增 （一）材料和试剂： 蟑螂埃希氏菌（Escherichia blattae ）的基因组DNA，寡核苷酸引物，dNTP，Taq 酶，Tris-HCL （pH8.3 ），MgCL2 ，KCL，琼脂糖，1×TAE ，上样缓冲液，SYBR ，溶胶液，玻璃奶，漂 洗液，TE 缓冲液 （二）PCR 反应 1．PCR 反应体系 模板DNA 100ng/ 100ul 引物 0.1umol/L- 1.0umol/L Tris-HCL(pH8.3) 10mmol/L PDF 文件使用 pdfFactory 试用版本创建 MgCL2 1.5mmol/L KCL 50mmol/L DNTP 200umol/L Taq 酶 2.5