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番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证-农学论文 番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证 李永平1,2,3，康建坂1,2,3，林珲1,2,3 （1福建省农业科学院蔬菜研究中心，福州350013；2福建省农业科学院作物研究所，福州350013，3福建省蔬菜工程技术研究中心，福州350013） 摘要：研究番茄ISSR-PCR反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的浓度及各引物的退火温度对扩增结果的影响，建立番茄ISSR- PCR反应的优化体系，为ISSR 技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。实验确定番茄ISSR-PCR 20 μL反应体系为：2.0 μL 10×PCR缓冲液，0.3 μmol/L引物，50 ng模板DNA，0.5 mmol/LdNTP，2 U TaqDNA聚合酶，各引物最佳退火温度有所不同。 关键词：番茄；亲缘关系；ISSR；优化 中图分类号：S795.9 文献标志码：A 论文编号：cja 基金项目：福建省自然科学基金项目“利用SSR和SRAP标记构建辣椒遗传图谱”(2014J01115)；福建省农业科技重大专项“茄果类蔬菜新品种选育与种业产业化研究”(2013NZ0002-3)。 第一作者简介：李永平，女，1974 年出生，福建顺昌人，硕士，研究方向：蔬菜育种。通信地址：350003 福建省福州市五四路247 号福建省农科院高新大楼1711，E-mail：[emailprotected]。 通讯作者：康建坂，男，1976 年出生，福建永春人，副研究员，硕士，研究方向：蔬菜育种。通信地址：350003 福建省福州市五四路247 号福建省农科院高新大楼1711，E-mail：[emailprotected]。 收稿日期：2015-08-20，修回日期：2015-11-16。 0 引言 在生物技术研究领域中，分子技术一直是研究的热点。ISSR 结合了SSR 和RAPD 的优点，克服了RFLP 与RAPD的不足，简单方便，可以检测到更高的种间遗传差异，稳定性也较高[1-3]。因此，ISSR 标记技术被广泛应用于遗传多样性[4-6]、遗传图谱构建[7-8]、种子纯度鉴定[9-10]、植物分类学[11]等研究中，但ISSR-PCR的扩增效果受物种、反应体系及扩增程序等的影响，不同作物最佳反应体系差异较大。 番茄(Lycopersicon esculentum)因果实营养丰富，具特殊风味，是在全世界栽培最普遍的果菜之一，中国各地也普遍种植。1994 年，加拿大蒙特利大学Zietkiewicze 等[12]利用了RAPD 技术优点和基因组中丰富的SSR序列信息，提出了一种新的分子标记技术（inter- simple sequence repeat，简单重复间序列，ISSR）。它可用少量DNA在没有分子生物学研究基础的情况下构建基因组指纹图谱[13-15]，由于可同时检测多个SSR座位，重复性好，被广泛应用于遗传多样性[16-19]、种质资源鉴定[12]、分子辅助育种[20]、基因定位[21]、种子纯度鉴定[22-23]、植物分类学[24]等方面。ISSR 标记能补充遗传图谱中一些RFLP标记稀少、间断或空白区，它在QTL定位中也逐渐得到较多的应用[1-2]。ISSR 是基于PCR 的分子标记技术，不同植物材料、实验材料及不同扩增条件都将影响其扩增效果[3-4]。 笔者对影响番茄ISSR-PCR反应体系主要因素进行优化实验，旨在建立番茄ISSR-PCR最佳反应体系，为ISSR技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。 1 材料与方法 1.1 供试材料 研究所用材料由福建省农业科学院蔬菜中心提供，体系建立材料为番茄高代自交系T9，验证材料为38个番茄高代自交系。 主要试剂为10×PCR buffer（含Mg+，Tiangen 公司产），TaqDNA 聚合酶（Tiangen 公司），dNTP（上海生工生物工程公司产），Mark2000（上海生工生物工程公司产）。ISSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 1.2 实验方法 1.2.1 基因组DNA的提取与检测各番茄品种选取3株健壮、无病虫害、具有本品种特征特性的植株混合取样，每株摘取1~2 片幼小、舒展的心叶，用改进的微量CTAB法[5-8]提取DNA。加入1 μLRNase，37℃水浴30 min，纯化DNA。检测各样品的纯度并计算其浓度，将各样品浓度稀释至50 ng/μL 备用。用8 g/L 琼脂糖凝胶电泳，检测