烟碱降解菌SCUEC2菌株分离及其降解特性.docVIP

烟碱降解菌SCUEC2菌株的分离及其降解特性-农学论文 烟碱降解菌SCUEC2菌株的分离及其降解特性 李 阳１，杨振飞１，马婷婷１，陈 涛２，龚传清２，李永辉２，李晓华１ （１．中南民族大学生命科学学院／生物技术国家民委重点实验室，武汉 ４３００７４；２．湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 ４４１００３） 摘要：以烟碱为惟一碳源，从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离得到１株烟碱降解菌，为蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）ＳＣＵＥＣ２。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ时，发酵１０ ｈ后烟碱降解率达到８８．８０％。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度为７．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率和菌株生长呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。ＳＣＵＥＣ２菌株发酵液经ＨＰＬＣ检测，结果显示，烟碱的保留时间为５．２５ ｍｉｎ左右，在培养到１６ ｈ时，烟碱峰峰面积明显减小，并在保留时间为１１．７９ ｍｉｎ左右处出现一个新色谱峰，表明有中间代谢产物产生。 关键词 ：烟碱；生物降解；蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）；降解特性 中图分类号：Ｑ９３９．１１＋２；Ｓ５７２；Ｓ１５４．３ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1586-04 DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.013 烟碱俗称尼古丁（ｎｉｃｏｔｉｎｅ），是烟草中的主要生物碱。烟碱对人体有害，很容易被人体吸收，是吸烟上瘾的主要物质，会引起人体的心血管疾病［１］。烟碱易溶于水，在烟草种植和香烟生产上很容易造成固体和液体的高浓度污染，严重污染环境和威胁人类健康。欧盟已将每千克烟碱含量超过５００ ｍｇ的烟草废弃物规定为“有毒有害物”，其他一些国家也规定了各自相应的标准［２，３］。因此，烟碱降解成为迫切需要解决的问题，而利用微生物降解烟碱是一种低成本、高效率且对环境影响小的方法［４］。近年来，微生物降解烟碱的研究受到关注，降解烟碱的微生物主要有嗜烟碱节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ）［５－８］、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）［３，９－１３］、中间苍白杆菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）［１，１４］、土壤杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）［１５－１７］、红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）［１８］、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）［１９］等。本研究从湖北省襄阳市烟草种植地土壤分离出１株新菌株蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ），具有较高的降解烟碱性能，通过对其降解性能进行研究， 旨在为降低烟叶和烟厂废弃物中烟碱含量提供依据。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．1．１ 样品 土壤样品采自湖北省襄阳市烟草种植地土壤。 １．1．２ 培养基 烟碱培养基：１３．３０ ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，４．００ ｇ ＫＨ２ＰＯ４，０．１０ ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．００ ｇ酵母粉，１０．００ ｍＬ微量元素（１．００ ｇ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．４０ ｇ ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ，０．２０ ｇ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．２０ ｇ ＣｕＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．０２ ｇ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，用０．１０ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液溶解定容至０．１０ Ｌ），用去离子水定容至１．００ Ｌ，自然ｐＨ。高压蒸汽灭菌后，加入一定量烟碱（用０．２２ μｍ滤膜过滤）。烟碱分离培养基：烟碱培养基中加入１．８％的琼脂。种子培养基：１０．００ ｇ胰蛋白胨，５．００ ｇ酵母浸粉，１０．００ ｇ ＮａＣｌ，先溶于０．９０ Ｌ去离子水，用５．００ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液调ｐＨ至７．００，再用去离子水定容至１．００ Ｌ。培养基１２１ ℃高压蒸汽灭菌２０ ｍｉｎ。 １．１．３ 主要试剂和仪器 烟碱（纯度≥９８％） 购自洛阳天科生物工程有限公司；ＵＶ－６１００ＰＣ紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００高效液相色谱仪（美国戴安公司）；ＨＺ－９２１１Ｋ空气恒温振荡器（太仓市华利达实验设备有限公司）；ＣＲ２２Ｇ高速冷冻离心机（日本日立公司）。 １．２ 烟碱降解菌的分离 称取２．００ ｇ土壤样品于２０．００ ｍＬ烟碱培养基，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养。用０．９０％生理盐水梯度稀释，涂布于烟碱分离培养基，于３０ ℃培养，挑取菌株划线分离纯化。分别将纯化的菌株接入烟碱培养基中，于３０ ℃、１