《-DNA文库的构建及筛选技术》课件.pptVIP

基因工程;;第三章 基因工程相关技术;一 基因组DNA文库的构建 二 cDNA基因文库的构建 三 基因克隆的筛选策略 四 DNA文库的保存 ;基因文库(gene library)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在。 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库和cDNA文库。;基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。 某一生物的任何组织材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。;cDNA文库：材料来自mRNA，含有全部蛋白编码基因的cDNA，序列信息量远小于基因组文库。 不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，mRNA种类和丰度不同，即表达谱不同， 因此同种生物体的cDNA文库随表达谱变化而变化。;*;*;*;若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 ;;转化率的用途;;;;2、基因组DNA的切割;3、载体和受体的选择与制备 几种载体的最大装载量：质粒≤ 15 kb，λ-DNA ≤ 25 kb，柯斯质粒≤ 45 kb，BAC ≤ 300 kb，YAC ≤ 1000 kb。; 用于基因文库构建的受体： 根据载体使用大肠杆菌或酵母菌，根据载体不同，需要对受体制备感受态或进行合适的培养。;*;*;二、 cDNA基因文库的构建; 1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。 2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。;（二）、cDNA文库的构建： 1、RNA的分离 mRNA是构建cDNA文库的起始材料。 总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪。 通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。 利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。 ;;反转录过程中为cDNA两端引物合理的人工接头序列是关键（试剂盒），可以方便定向克隆和克隆子的处理。 总cDNA的分级分离：采用排阻层析柱，去除过大和过小的cDNA分子，???留500bp至8kb的总cDNA，以提高连接后文库的质量。;*;*;*;*;;*;*;*;*;;重组酶克隆策略的cDNA文库（gateway）;*;*;小结