《第十章分子生物学技术》课件.pptVIP

第一节 核酸及蛋白质操作技术 DNA操作技术 RNA操作技术 蛋白质操作技术 DNA操作技术 DNA的分离 DNA的纯化 DNA的鉴定 DNA的扩增 及基因文库的构建 （一）核酸的分离与纯化 核酸提取的主要步骤 来源：细胞（包括培养细胞）、病毒 温和裂解，溶解核酸，使核酸与蛋白（组蛋白）分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、DNA/RNA及其他大分子。 抑制RNase活性是提取RNA的关键 在实验中，严格控制内源性和外源性RNase的污染。 RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外源性RNase 存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。 各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。 RNA操作中的要求 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。 2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合 物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 RNA的分离和纯化-TRIzol试剂法 原理： 首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，RNA存在于水相。 经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等； 存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。 （4） 探针的标记 2、DNA测序鉴定 通过对DNA测序，利用序列分析来确定该DNA分子是否为目标分子。 （三）核酸的扩增 1、DNA的体内扩增 质粒在宿主细胞内的复制 2、DNA的体外扩增 PCR扩增（相应的PCR扩增技术） 引物设计的原则——可采用primier 5 or Oligo 6软件设计 ① 引物的长度 通常在15～30个核苷酸之间。引物越长，特异性越高，合成的成本也越高。常见的引物长度在20个碱基左右。 ②G/C含量 引物的G/C含量一般在 50％左右， G/C含量高，引物容易与模板结合，但如果过高，引物和模板结合过于紧密，会影响变性。 G/C含量低，引物与模板不易结合。 ③引物二聚体 在引物中不应出现 ④ 发夹结构 在引物中不应出现 ⑤ 结合位点 引物在目的DNA应该只存在一个结合位点，如果有多个结合位点，扩增时会出现非特异性扩增产物。 ⑥引物的3端最好以G/C结束 有利于延伸的正确进行。 （四）、文库的构建 采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体DNA切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组DNA的集合即称为基因组文库。 以细胞mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应cDNA的大量克隆，这些克隆就构成了cDNA文库。 2、人工染色体构建 ? 1983年，美国的Dana-Farber癌症研究所