《动物基因组DNA和RNA的提取》课件.pptVIP

3. 核酸制备的一般步骤： 3. 注意事项——材料准备 3. 注意事项——细胞裂解 3. 注意事项——核酸分离、纯化 3. 注意事项——核酸沉淀、溶解 4. DNA提取常见问题 5. DNA提取常见问题 5. DNA提取常见问题 操作步骤 4.?配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌； 5.?操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换； 6.?设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 思考： 如何从总RNA中分离mRNA? 1．材料： 组织或者细胞 2. 方法： TRIzol法，试剂盒 四. 动物基因组总RNA的提取 总RNA提取试剂盒 亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸：变性细胞内及核蛋 白复合物，释放RNA；有效抑制核酸酶。 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（pH4.7）：酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA。 1．TRIzol试剂 2．氯仿 3．异丙醇 4．75%乙醇（DEPC水配制） 5．DEPC水 TRIzol法提取RNA 试剂准备: TRIzol法（组织） 戴一次性手套将组织样品从液氮中取出，用干灭过的剪刀将样 品外包裹用纱布及表层的肉样剪掉，然后放入干灭过的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状； 用1ml一次性塑料吸头挑取细末装入灭过菌的7mL一次性塑料离心管中用电子天平进行称量，每管中称取0.2g肉样； 往管中加入2 mL TRIZOL，用力振荡后于15-30?C温育5min以裂解细胞，再加入0.4 mL三氯甲烷并剧烈振荡15s后于15-30?C温育3min； 将离心管置于冷冻离心机2-4?C 10000rpm/min离心15min，小心吸取上清转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15-30?C温育15min以沉淀总RNA； 将离心管置于冷冻离心机2-8?C 10000rpm/min离心15min，弃上清； 加入2mL用冰预冷的 75%乙醇漂洗，2-8?C 7000 rpm/min离心 5min，弃上清，于室温干燥10min； 加入适量DEPC处理水并于55-60?C水浴 温育10?min以溶解总RNA，取适量用于 DU640核酸蛋白测定仪测定浓度。 余下总RNA样品的水溶液须保存在-80?C。 TRIzol法（细胞） 将1mlTrizol加入1-5×105细胞（6 孔板）中，室温放置3min。 将全部溶液转移到1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 4℃离心，12000g×15min，取上清 液(约400ul)。 加入0.4ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 4℃离心，12000g×10min，弃上清。 加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。 晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。 RNA电泳检测和定量 RNA电泳检测 核酸浓度仪检测 注意事项 1.?? 所有玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤2hr或更长时间； 2.?? 塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗； 3.?? 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干； RNA电泳检测和定量 核酸浓度仪检测 纯度： OD260/OD280≥1.8 浓度：稀释倍数×读数 比色皿需经浓盐酸：甲醇（1：1）溶液浸泡！ RNA电泳检测和定量 琼脂糖电泳检测 制备1.2%凝胶：将1.2g琼脂糖溶于63mL DEPC处理水，冷却至60?C，加入20mL 5?甲醛凝胶电泳缓冲液和17mL 37%甲醛，混匀后在通风橱内灌制凝胶，于室温放置30min，使凝胶凝固; 制备总RNA样品：在一灭过菌的0.5mL的微量离心管中混合4.5μL总RNA，2μL 5?甲醛凝胶电泳缓冲液，3.5μL 37%的甲醛和10μL去离子甲酰胺，于65?C水浴温育15min，冰浴冷却，稍加离心使管内液体集中于管底。往管中加入2μL甲醛凝胶加样缓冲液和1μL 1mg/mL的EB溶液，混匀; 电泳检测：将已凝固的凝胶浸入1?甲醛凝胶电泳缓冲液中，5V/cm